Б. Метод с резазурином

Принцип метода. Метод основан на восстановлении резазурина окислительно-восстановительными ферментами, выделяемыми в молоко микроорганизмами. По продолжительности изменения окраски резазурина оценивают бактериальную обсемененность сырого молока.

Приборы. Редуктазник; штатив с пробирками; пипетки градуированные вместимостью 1; 10 см³.

Материалы и реактивы. Молоко сырое; рабочий раствор резазурина.

Последовательность определения. В пробирки наливают по 1 см³ рабочего раствора резазурина и по 10 см³ исследуемого молока, закрывают резиновыми пробками и смешивают путем медленного трехкратного перевертывания пробирок. Пробирки помещают в редуктазник с температурой воды (37+1) ^оС.

Вода в редуктазнике после погружения пробирок с молоком должна доходить до уровня жидкости в пробирке или быть немного выше. Пробирки с молоком и резазурином на протяжении анализа должны быть защищены от света прямых солнечных лучей.

Время погружения пробирок в редуктазник считают началом анализа. Показания снимают через 20 мин и 1 ч. После снятия показаний через 20 мин пробирки с обесцвеченным молоком удаляют из редуктазника. Появление окрашивания молока в этих пробирках при встряхивании не учитывают. По истечении 1 ч. оставшиеся пробирки вынимают из редуктазника, осторожно переворачивают.

В зависимости от продолжительности обесцвечивания или изменения цвета молоко относят к одному из четырех классов, указанных в табл 7.

Таблица 7

Класс молока	Время обесцве-чивания или изменения окраски, ч	Ориентировочное количество бактерий в 1 см3 молока, КОЕ	Окраска молока
Высший	1,5	До 300 тыс.	От серо-сиреневой до сиреневой со слабым серым оттенком
I	1	От 300 тыс. до 500 тыс.	То же
II	1	От 500 тыс. до 4 млн.	Сиреневая с розовым оттенком или ярко-розовая
III	1	От 4 млн. до 20 млн.	Бледно-розовая или белая

Фосфатаза

Фосфатаза относится к группе ферментов, катализирующих расщепление и синтез сложных эфиров фосфорной кислоты. Фосфатаза не устойчива к нагреванию, поэтому реакцию на фосфатазу в молоке и молочных продуктах производят с целью контроля пастеризации молока. Фосфатаза обладает большей чувствительностью к нагреванию по сравнению с пероксидазой, она инактивируется при температуре пастеризации молока ниже 80 ^оС.

А. Определение фосфатазы с помощью динатриевой соли

фенилфосфорной кислоты

Принцип метода. Метод основан на гидролизе динатриевой соли фенилфосфорной кислоты фосфатазой, содержащейся в сыром молоке. Выделившийся при гидролизе фенол образует с индикатором 4-аминоантипирином окрашенный в розовый цвет комплекс. Для прекращения действия фосфатазы и осаждения белков применяют осадитель системы цинк-медь.

Приборы. Штатив с пробирками; пипетка вместимостью 2 см³; пипетки градуированные вместимостью 5 см³; водяная баня или термостат с температурой 40-45 °С.

Материалы и реактивы. Молоко сырое, пастеризованное и кипяченое; смесь динатрийфенилфосфата с 4-аминоантипирином (раствор субстрата); осадитель системы цинк-медь.

Последовательность определения. В пробирку отмеривают пипеткой 3 см³ исследуемой пробы (сырого и пастеризованного) молока или сливок и 2 см³ субстрата, перемешивают содержимое пробирки, закрывают пробкой и помещают в водяную баню (или термостат) с температурой 40- 45 ^оС на 30 мин.

В пробирку после бани добавляют 5 см³ осадителя системы цинк-медь. Тщательно перемешивают содержимое пробирки и снова помещают в водяную баню (термостат) на 10 мин.

Вынув пробирку из бани, производят визуальное определение окраски раствора над осадком белка, используя в качестве контроля пробу с кипяченым молоком. При наличии фосфатазы (сырое молоко) раствор окрасится в темно-красный или розовый цвет, при его отсутствии (кипяченое и пастеризованное молоко) раствор будет бесцветным.

При оценке реакции учитывается только цвет, но не прозрачность раствора. Чувствительность метода позволяет определить содержание

0,3 % сырого молока в пастеризованном продукте.

Контроль эффективности пастеризации сливок ведут аналогично контролю пастеризации молока.

При контроле эффективности пастеризации молока по определению фосфатазы можно использовать вместо динатриевой соли фенилфосфата и 4-аминоантипирина фенолфталеинфосфат натрия.

Б. Определение фосфатазы с помощью фенолфталеинфосфата натрия

Принцип метода. Метод основан на гидролизе фенолфталеинфосфата натрия фосфатазой с освобождением фенолфталеина, который в щелочной среде дает розовое окрашивание.

Приборы. Штатив с пробирками; пипетка вместимостью 2 см³; пипетки градуированные вместимостью 5 см³; водяная баня или термостат с температурой 40-45 °С.

Материалы и реактивы. Молоко сырое, пастеризованное и кипяченое; фенолфталеинфосфат натрия.

Последовательность определения. В пробирки отмеривают 2 см³ цельного или обезжиренного молока и 1 см³ фенолфталеинфосфата натрия. Для сливок дополнительно вносят 2 см³ воды. После этого закрывают пробирки резиновыми пробками и взбалтывают. Помещают пробирки в водяную баню (или термостат) с температурой 40- 45 ^оС и определяют окраску содержимого пробирок через 10 мин и через час. Если исследуемое молоко и сливки не были пастеризованы, то содержимое пробирок приобретает окраску от светло-розовой до ярко-розовой.