MOLEKULJARNO-GENETICHESKII_UROVEN

Задание 5. Методика приготовления препаратов метафазных

хромосом человека

Существуют п р я м ы е и н е п р я м ы е методы получения препаратов хромосом на стадии метафазы. Прямые методы не требуют культивирования клеток и позволяют дать заключение через несколько часов после взятия материала на исследование. У человека берут клетки тканей с высокой митотической активностью – это клетки красного костного мозга, опухоли, ворсинок хориона. Чаще используют непрямые методы получения размножающихся клеток путем их культивирования в искусственных питательных средах.

Объектом для приготовления препаратов могут служить кровь,

клетки околоплодной жидкости и др. Наиболее удобным объектом является культура лимфоцитов периферической крови – берут 1-2 мл венозной крови и добавляют ее в смесь питательной среды с фитогемагглютинином (стимулирует митоз). Время культивирования лимфоцитов – 48-72 часа.

Для остановки процесса деления клеток на стадии метафазы используют колхицин, который добавляют в культуру клеток за 2-3

часа до окончания культивирования. Важным условием для получения метафазных пластинок (метафазные хромосомы с хорошим разбросом на предметном стекле) является гипотонизация клеток, для этого добавляют гипотонический раствор хлорида кальция или цитрата натрия. Клетки набухают, хромосомы разобщаются и свободно располагаются в цитоплазме (рис. 3, 4). В

результате такой последовательной обработки культуры клеток образуется клеточная суспензия, которую наносят на предметное

60

стекло, фиксируют, высушивают и окрашивают красителями.

Анализируют препараты под большим увеличением микроскопа с использованием иммерсионного объектива, отыскивая такие метафазные пластинки, в которых хромосомы располагаются в одной плоскости, и фотографируют их.

Задание 6. Проверка усвоения материала

Проверьте усвоение материала занятия по тестовым заданиям с выбором одного или нескольких правильных ответов (стр. 97).

А у д и т о р н а я р а б о т а

Задание 7. Центромерный индекс

В зависимости от положения центромеры хромосомы подразделяют на мета-, субмета- и акроцентрические. Тип хромосомы устанавливают с помощью вычисления центромерного индекса.

Центромерный индекс (IС) – это отношение длины короткого плеча ко всей длине хромосомы, выраженное в процентах (или долях единицы). Центромерный индекс метацентрических хромосом от 45%

до 50%, субметацентрических хромосом более 25% и до 45%,

акроцентрических – меньше или равен 25%.

– Вычислите центромерные индексы X- и Y-хромосом, если известно, что длина Х-хромосомы в среднем 6,8 мкм, длина короткого плеча – 2,6 мкм. Длина Y-хромосомы – 2,8 мкм, длина короткого плеча – 0,5 мкм. К какому типу хромосом относятся X- и Y-хромосомы с учетом центромерного индекса?

61

– Определите тип хромосом человека по значениям IС (%): 1 – 49; 2 – 38; 3 – 47; 4 – 29; 5 – 29; 6 – 37; 7 – 39; 8 – 40; 9 – 36; 10 – 33; 11 – 33; 12 – 29; 13 – 18; 14 – 18; 15 – 18; 16 – 40; 17 – 34; 18 – 29; 19 – 45; 20 – 45; 21 – 25; 22 – 25.

Задание 8. Кариотип и идиограмма хромосомного набора

человека

Графический рисунок кариотипа называется идиограммой (рис.

2).

На идиограмме хромосомы гаплоидного набора расположены в порядке уменьшения их длины.

Хромосомы объединены в группы в зависимости от длины (крупные, средние, мелкие), положения центромеры (тип хромосомы), наличия вторичных перетяжек и спутников.

Заполните табл. 5 «Характеристика метафазных хромосом человека».

Рис. 2. Идиограмма хромосомного набора мужчины

62

Таблица 5

Характеристика метафазных хромосом человека

Задание 9. Основные методы окрашивания хромосом

Определить число, тип хромосом и их групповую принадлежность позволяет метод равномерной окраски – рутинный.

Но индивидуализировать хромосомы можно только с помощью методов дифференциальной окраски, которые основаны на неоднородности хромосом по длине, обусловленной различным

63

чередованием в них эу- и гетерохроматина, асинхронностью12 \

репликации и конденсации районов хромосом и др. Неоднородность хромосом по длине проявляется в наличии окрашенных поперечных полос – мест связывания с определенным красителем (рис. 3).

Поперечным темным полосам (бэндам), выявляемым с помощью дифференциальной окраски, присвоены определенные номера,

относительно них в хромосомах картируют гены. Составлен каталог генов человека, для каждого гена указывается: код гена (латынь,

состоит из 2-6 символов, например AMY1 – ген амилазы слюны),

региональная локализация гена в хромосоме (номер хромосомы,

плечо, номера сегментов в соответствии с международной номенклатурой, основанной на картине дифференциальной окраски хромосом, например AD1-21q21-22·1 – Альцгеймера болезнь,

BSP07q22-t – синий пигмент колбочек сетчатки).

Рис. 3. Схема рисунка хромосом человека при дифференциальной окраске (G-метод)

64

Ознакомьтесь по табл. 5 с основными методами окрашивания хромосом человека. По рис. 3 сравните характер дифференциальной окраски (G-диски) хромосомы 7 из группы С и Х-хромосомы,

которые имеют одинаковые морфологические характеристики и при рутинной окраске не отличаются.

Задание 10. Половой хроматин (X- и Y-хроматин)

Х - х р о м а т и н ( т е л ь ц е Б а р р а ) – это инактивированная и конденсированная одна из двух Х-хромосом в ядрах соматических интерфазных клеток женщины. В клетках женского эмбриона она инактивируется и конденсируется примерно на 16-20-ый'день развития. X-хроматина на единицу меньше числа Х-хромосом в кариотипе. Y-хроматин представляет собой блок гетерохроматина в длинном плече Y-хромосомы и выявляется в интерфазных ядрах соматических клеток мужчин. Число Y-хроматина равно числу Y-

хромосом в кариотипе.

Препараты полового хроматина можно приготовить, используя лейкоциты, клетки слизистой ротовой полости, фибробласты кожи и клетки волосяной луковицы, окрашивая их ацетоорсеином или флуоресцентными красителями.

Рассмотрите по учебной таблице препараты X- и Y-хроматина в клетках эпителия ротовой полости человека. Х-хроматин выявляется с внутренней стороны ядра в виде плотной, хорошо окрашенной глыбки, имеющей форму треугольника или овала. Клетки мужчины,

как правило, без этой глыбки. Зарисуйте клетки эпителия женщины и мужчины и обозначьте Х-хроматин, Y-хроматин.

66

О т в е т ь т е н а в о п р о с ы :

Каков биологический смысл явления гетерохроматизации одной из двух Х-хромосом женского организма у человека и млекопитающих:

а) число функционирующих генов Х-хромосомы в мужском и женском организмах становится уравненным;

б) число функционирующих генов Х-хромосомы в мужском и женском организмах становится удвоенным?

Сколько X- и Y-хроматина выявляется в эпителиальных клетках слизистой полости рта человека при следующих хромосомных наборах в кариотипах:

а) 45,ХО (синдром Шерешевского-Тернера);

б) 47,XXY; 48,XXYY (разные варианты синдрома Клайнфельтера);

в) 47, XXX (синдром трипло-Х);

г) 48,ХХХХ (синдром тетра-Х)?

Учебно-исследовательская работа студентов (УИРС)

Задание 11. Кариотипический анализ

Постоянство числа и формы хромосом у каждого биологического вида является одной из важнейших его характеристик. Однако внутри вида между индивидуумами могут быть различия (полиморфизм) по отдельным хромосомам.

Основная задача кариотипического анализа состоит в установлении качественных и количественных отклонений хромосом от нормы. Ознакомьтесь с методическими указаниями к кариотипическому анализу хромосом человека и проанализируйте по рис. 3 и 4 метафазные пластинки (рутинная окраска).

67

Методические указания к кариотипическому анализу

метафазных хромосом человека

1.На метафазной пластинке найдите шесть самых крупных хромосом группы А, обозначьте каждую хромосому буквой А.

2.Найдите четыре крупные субметацентрические хромосомы группы В, обозначьте каждую хромосому буквой В.

3.Найдите шесть средних акроцентрических хромосом группы

D, обозначьте каждую хромосому буквой D.

4.Найдите четыре (в кариотипе женщины) мелкие акроцентрические хромосомы группы G, обозначьте их. Обратите внимание на то, что Y- хромосома по своим параметрам сходна с хромосомами группы G и будет считаться вместе с ними, поэтому в кариотипе мужчины таких хромосом насчитывается 5.

5.Найдите четыре мелкие метацентрические хромосомы группы

F, обозначьте каждую хромосому буквой F.

68