MOLEKULJARNO-GENETICHESKII_UROVEN

фрагмент.

Задание 13. Особенности репликации наследственного

материала у ДНК- и РНК-содержащих вирусов

УДНК-содержащих вирусов репликация сходна с репликацией

уэукариот, у РНК-содержащих вирусов она существенно отличается.

1. У вирусов гриппа, бешенства, везикулярного стоматита,

свинки, кори и др. матрицей служит исходная РНК. При участии специального фермента РНК-репликазы (ген содержится в РНК вируса) на РНК матрице синтезируется РНК.

2. У РНК-онкогенных вирусов репликация протекает по схеме:

транскрипцию?

Задание 14. Сравнительная характеристика репликации у

про- и эукариот

Ознакомьтесь (табл. 8) с особенностями репликации хромо-

сомной ДНК прокариот и ядерной ДНК эукариот.

3'... ГГТГЦТАЦТ... 5'

Нарисуйте схему репликации данного фрагмента ДНК.

Обозначьте на дочерних ДНК 5'- и 3'-концы, старые и новые полинуклеотидные цепи, укажите направление их синтеза.

Обозначьте количество водородных связей между комлементарными основаниями в дочерних ДНК.

Задача 2. Учитывая, что ДНК-полимераза наращивает полинуклеотидную цепь только в одном направлении (5' → 3'),

21

укажите на схеме репликационной вилки, – по какой из цепей пойдет непрерывный, по какой – прерывистый (фрагментами Оказаки)

синтез новых полинуклеотидных цепей.

Какой фермент «сшивает» фрагменты Оказаки?

Задача 3. Роль геликазы в репликации ДНК. Геликаза – один из основных ферментов репликации ДНК. Ген геликазы у человека локализован в аутосоме 8. У гомозигот (аа) по мутантному гену геликазы накапливаются мутации в клетках разных тканей и органов.

В итоге развивается наследственная болезнь – синдром Вернера,

ведущая к преждевременной старости. К 20 годам больные выглядят как глубокие старики.

Какую функцию выполняет геликаза? Почему при с. Вернера развивается преждевременная старость?

Задача 4. Скорость репликации ДНК у прокариот. Длина ДНК бактерии Escherichia coli – 1100-1400 мкм, в еѐ составе 3×106 п. н.

Скорость ее репликации – 10 п. н./мин. Сколько времени длится репликация всей кольцевой молекулы ДНК E. coli?

22

Задача 5. Скорость репликации ядерной ДНК человека.

В гаплоидном геноме человека содержится 3,2×109 п. н. Самая большая хромосома человека – аутосома 1 – содержит 263×106 п. н.

Определите, сколько времени потребовалось бы для репликации такой молекулы за счет только одной репликационной вилки,

движущейся со скоростью 50 п. н./сек.?

Чем можно объяснить более медленную скорость репликации у эукариот, по сравнению с прокариотами? Объясните, почему удвоение всех хромосом в клетке человека происходит в течение всего 7-12 часов?

Задание 16. Репарация ДНК

Во время репликации, ДНК и рекомбинации ядерного материала в ней (сестринские хроматидные обмены, кроссинговер и др.)

возможны «ошибки» в ДНК, и, как следствие этого, могут возникнуть мутации. Однако большинство «ошибок» и повреждений ДНК устраняется благодаря репарации – процессу, обеспечивающему исправление повреждений в ДНК.

Ознакомьтесь с видами репарации ДНК и их особенностями

(табл. 9). Обратите внимание на сходство репликации и репарации ДНК: оба процесса основаны на комплементарном спаривании азотистых оснований; при репликации и репарации ДНК работают сходные ферменты (ДНК-полимераза, лигаза). В некоторых клетках ферменты репарации отсутствуют.

23

О т в е т ь т е н а в о п р о с ы :

Вкаких клетках (делящихся или нет) вероятность нарушений репликации ДНК больше, но более эффективна репарация ДНК?

Вкаких клетках человека (в яйцеклетках или сперматозоидах)

отсутствуют ферменты репарации ДНК?

24

Учебно-исследовательская работа студентов (УИРС)

Задание 17. Генетический полиморфизм человека

Генетический полиморфизм (разнообразие) человека заключается в наличии на молекулярном уровне небольших отклонений в нуклеотидной последовательности, совместимых с нормальным функционированием генома, но приводящих к вариациям, в итоге возникает неповторимость, уникальность каждого человека. Межвидовые различия в строении ДНК заключаются в количестве и последовательности нуклеотидов в ее молекулах.

Внутривидовые различия в строении ДНК сводятся в основном к неоднозначной последовательности нуклеотидов в экзонах уникальных генов и, особенно, в интронах; различной локализации МГЭ и гетерохроматина и др.

Ознакомьтесь с видами генетического полиморфизма ДНК человека (табл. 10). Обратите внимание, что SNP, cSNP, STR, VNTR –

сайты ДНК-последовательностей с известной локализацией – являются удобными генетическими маркерами в ДНК-диагностике.

Таблица 10

Генетический полиморфизм человека

Задание 18. ДНК-диагностика

ДНК-диагностика (генотипоскопия) – метод идентификации личности на основании анализа особенностей ДНК. Используется при медико-генетическом консультировании, пренатальной диагностике,

в криминалистике, определении биологического отцовства, кровного родства, а также при диагностике ряда инфекционных заболеваний

(исследуют ДНК возбудителя). ДНК методы малоинвазивны

(достаточно не более 1-2 мл крови, в ряде случаев – 1-2 клетки или 1

молекула ДНК, или 1 ген). Этот метод наиболее достоверный для диагностики моногенных наследственных заболеваний.

Преимущество по сравнению с другими методами состоит в том, что он позволяет определить первопричину болезни (локализацию гена,

характер его повреждения). При этом выявляются даже минимальные нарушения ДНК, такие как единичные нуклеотидные замены и вставки, микроделеции и инверсии, которые не идентифицируются при других методах. В основе большинства методов ДНК-

диагностики лежит амплификация (увеличение числа копий)

фрагментов ДНК или методом клонирования in vivo, или с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) in vitro.

Сущность амплификации ДНК in vivo:

1. Получают исследуемый ген (фрагмент ДНК), «вырезая» его из

26

ДНК специальными ферментами, или синтезируя искусственно методом обратной транскрипции (иРНК → ДНК).

2. Встраивают полученный ген (фрагмент ДНК) в плазмиду

(плазмиды обладают автономной репликацией, благодаря чему можно получить множество необходимых копий генов и их продуктов).

По такой же схеме синтезируют ДНК-зонды (нормальные или несущие определенные мутации); их метят (например, радиоактивной меткой) и используют для определения характера повреждения в исследуемых фрагментах ДНК методом гибридизации. Если иссле-

дуемый фрагмент ДНК гибридизируется (образует комплементарные пары) с нормальным зондом, то в этом фрагменте ДНК нет мутаций.

Создан банк диагностических ДНК-зондов, которые используются в диагностике ряда моногенных болезней.

Более совершенным и быстрым методом идентификации генома человека является ПЦР – многократное копирование (амплификация)

определенного фрагмента ДНК с помощью ДНК-полимеразы. При этом достаточно иметь 1-2 клетки, 1 молекулу ДНК, 1-2 гена или их фрагменты. Один цикл ПЦР слагается из 3-х стадий (рис. 4):

1)денатурация – разделение одной двухцепочечной молекулы ДНК на две одноцепочечные;

2)отжиг – присоединение праймеров (П.) – специфических олигонуклеотидов (затравки);

3)достраивание цепей ДНК.

27

Рис. 4. Схема амплификации ДНК

В итоге образуются две копии ДНК, которые служат матрицей для следующего цикла.

Благодаря ПЦР в течение короткого времени можно амплифицировать интересующий фрагмент ДИК в сотни или миллионы раз, что позволяет наблюдать амплифицированный участок после электрофореза (в гене) даже без применения ДНК-

зондов. Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе), в котором автоматически выполняются все необходимые операции. Для идентификации генома человека с использованием ПЦР достаточно

20 часов, для диагностики инфекционных заболеваний – 20 минут.

Ознакомьтесь с примерами наследственных и инфекционных заболеваний, диагностика которых основана на ПЦР (табл. 11).

28

Таблица 11

Примеры наследственных и инфекционных болезней,

диагностика которых основана на ПЦР

Р е ш и т е з а д а ч и :

Задача 1. Наличие в ДНК человека супервариабельных участков

позволяет провести точное определение отцовства или другого родства, т.к. дети наследуют от отца и матери (в большей или меньшей степени от каждого) особенности строения ДНК. Используя данные ДНК-анализа (рис. 5), сделайте заключение об истинном отцовстве одного из двух предполагаемых отцов.

29