3.4.Характеристика функціонального стану шлунка при експерименталь-ному хронічному некротичному панкреатиті

Дослідження функціонального стану шлунка у щурів із експериментальним хронічним некротичним панкреатитом проводили на 10 та 63 добу після останньої ін’єкції L-аргініну. Аналіз літератури показав, що через 10 днів після останнього введення амінокислоти спостерігаються максимальні зміни у структурі підшлункової залози, а саме відбувається деструкція до 90% ацинарної тканини. Через 2 місяці відбувається заміщення ацинарної тканини на жирову, екзокринна недостатність та зменшення діаметру протоків підшлункової залози, що відповідає клінічній картині хронічного панкреатиту. Тому для проведення дослідів були обрані саме такі часові проміжки.

Результати наших досліджень показали, що на 10 добу після останньої ін’єкції L-аргініну кислотність шлункового вмісту була на 100% вищою ніж у контролі (р<0,05) (Табл.5). При цьому спостерігалося зниження концентрації загального білка на 61,7% (р<0,05).

Таблиця 5

Концентрації складових шлункового вмісту щурів впродовж перебігу експериментального хронічного некротичного панкреатиту (m±m)

	Контроль	Панкреатит
		10 доба	63 доба
Соляна кислота, ммоль/л	2,09±0,32	4,18±1,04*	2,8±1,13
Загальний білок, мкг/мл	38,69±7,88	14,82±2,5*	12,29±2,74*
Гексозамін, мг%	4,28±0,17	3,26±0,17***	2,9±0,16***

Примітка. * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 щодо контролю

Отже, якість шлункового секрету під час перебігу хронічного панкреатиту змінюється. Підвищення кислотності шлункового соку супроводжується зменшенням в ньому вмісту білкових компонентів. Секрет шлункових залоз стає більш агресивним за рахунок збільшення кількості соляної кислоти в ньому, але травлення білків у шлунку при цьому погіршується.

Дослідження базальної шлункової секреції на 63 добу перебігу патології показали, що кислотність шлункового вмісту зменшилася, значення наблизились до контрольних (Табл.5). Таким чином, на 63 добу залишалась тенденція до підвищення кислотності шлункового соку, проте ці зміни не були статистично значущими. Натомість концентрація загального білка в секреті на 63 добу продовжувала знижуватись і була на 68,2% меншою, ніж у контролі.

Наші досліди показали, що вміст гексозаміну в секреті на 10 добу перебігу хронічного панкреатиту зменшився і був меншим на 23,8% (р<0,001) ніж такий у групи контрольних тварин. На 63 добу після останньої інєкції L-аргініном вміст даного показника був меншим від контрольних значень на 32,2% (р<0,001)(Табл.5). Отримані нами результати узгоджуються з даними про те, що у більшості хворих на хронічний панкреатит відзначалася збережена функціональна активність парієтальних і головних клітин при зниженні функції поверхнево-епітеліальних клітин слизової оболонки шлунка [].

Порівняння співвідношень амінокислотного складу шлункового вмісту тварин дослідної і контрольної груп, вказує на зміни метаболічних процесів у клітинах слизової оболонки шлунка у щурів з експериментальним хронічним некротичним панкреатитом. Так, міліграмвідсотковий вміст цистеїну і цистину у тварин з патологією підшлункової залози був менший від контролю на 30,6% (р<0,001) на 10 добу та на 33,3% (p<0,001) на 63 добу після останнього введення L-аргініну (Табл.5).

Вміст амінокислот таурину, гістидину та серину на 10 день після індукції патології був менше від контрольних значень на 18,2% (p<0,01). Натомість через два місяця перебігу хвороби рівень зазначених амінокислот майже відновився та наближався до контрольних значень (Табл.5).

Таблиця 5

Характеристика амінокислотного складу шлункового вмісту інтактних щурів і тварин із експериментальним хронічним некротичним панкреатитом (мг%; М±m)

Амінокислоти	Контроль	Панкреатит
		10 доба	63 доба
Цистеїн+цистин	0,36±0,02	0,25±0,02***	0,24±0,02***
Таурин+гістидин+серин	0,33±0,02	0,27±0,02**	0,3±0,01
Аланін+метіонін	0,3±0,01	0,25±0,02*	0,17±0,02***##
Аспарагін+гістамін	0,03±0,003	0,016±0,003*	0,015±0,003*
Глутамінова кислота+ треонін	0,7±0,02	0,79±0,01**	0,77±0,03
Пролін+оксипролін	0,46±0,01	0,57±0,02**	0,71±0,07***##
Гліцин+аспарагінова кислота	0,63±0,02	0,53±0,04*	0,49±0,03**
Орнітин+лізин+аргінін	0,33±0,01	0,39±0,02*	0,32±0,03#
Валін+тирозин	0,19±0,01	0,26±0,02**	0,2±0,02#
Лейцин+фенілаланін	0,7±0,02	0,55±0,03***	0,44±0,02***#
Ізолейцин+триптофан	0,54±0,01	0,54±0,03	0,34±0,02**##

Примітки. * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 щодо контролю. # - р<0,05; ## - р<0,01 щодо серії дослідів, поставленої на 10 добу перебігу хронічного панкреатиту. n – кількість тварин із групи

Результати дослідження показали, що індукція хронічного некротичного панкреатиту також впливає на рівень метіоніну та аланіну. Так вміст зазначених сірковмісних амінокислот був нижчий від контролю на 10-ту і 63 добу на 16,7% (p<0,05) і 43,3% (p<0,001) відповідно (Табл.5).

Сірковмісні амінокислоти та гістидин є складовими ферментів, а також їх активних центрів. Вірогідне зменшення їх міліграмвідсоткового вмісту в шлунковому соці при зменшенні концентрації загального білка підтверджує наше припущення щодо пригнічення синтезу і секреції протеолітичних ферментів у шлунку.

На фоні зменшення міліграмвідсоткового вмісту гістидину на 10 добу після останнього введення L-аргініну цілком логічним є зниження рівня гістаміну, а разом із ним і аспарагіну на 46,7% (р<0,05) (Табл.5). Ці результати вказують на те, що посилення секреції соляної кислоти парієтальними гландулоцитами відбувається не за рахунок стимуляції її гістаміном. Оскільки гастрин, зв’язуючись з ССК₂-рецепторами на ECL клітинах викликає вивільнення гістаміну в порожнину шлунка, імовірно, в наших дослідах не відбувається залучення і цього механізму активації секреторного процесу. До того ж, гастрин є потужним стимулятором секреції ферментів, але наші результати, як уже зазначалось вище, свідчать про пригнічення синтезу цих компонентів шлункового соку. Можна припустити, що підвищення секреції соляної кислоти відбувається за рахунок посилення активуючих впливів нейронами парасимпатичного відділу автономної нервової системи до обкладових клітин залоз, на яких розміщені М₃ холінорецептори. На користь цієї гіпотези свідчать дослідження Lechin F. і співавторів [ ], які встановили, що L-аргінін, за допомогою якого ми моделювали панкреатит, посилює активність як симпатичного, так і парасимпатичного відділів автономної нервової системи.

На 63 добу після індукції патології концентрація аспарагіну і гістаміну в шлунковому вмісті була на 50% нижчою (р<0,05), ніж у інтактних тварин (Табл.5). При цьому залишалась тенденція підвищення кислотності шлункового вмісту у щурів із експериментальною моделлю панкреатиту, проте різниця між значеннями показника в контролі і в досліді не мала статистичної значущості.

Одночасно зі зниженням рівня гістаміну в шлунковому секреті на 10 добу перебігу патології підвищувалась концентрація глутамінової кислоти та треоніну на 12,9% (р<0,01) Вміст амінокислот таурину, гістидину та серину на 10 день після індукції патології був менше від контрольних значень на 18,2% (p<0,01). Натомість через два місяця перебігу хвороби рівень зазначених амінокислот майже відновився та наближався до контрольних значень (Табл.5).

. Глутамінова кислота є джерелом енергії для епітеліальних клітин, приєднавши до себе атом азоту, дана амінокислота перетворюється на глутамін, та знешкоджує при цьому аміак. Треонін, зв’язуючись з муцинами, бере участь у забезпеченні бар’єрної функції слизу, а також разом із проліном збільшує продукцію колагену і еластину. Дані джерел літератури свідчать, що методами полімеразної ланцюгової реакції, вестерн-блоттінгу та імуногістохімії на парієтальних клітинах шлункових залоз щурів встановлена експресія гетеродимерних 4F2-LAT2 транспортерів амінокислот, які залучені до секреції соляної кислоти [ ]. Також встановлено, що екструзія Н⁺, викликана гістаміном, збільшується на 50% в присутності глутаміну або цистеїну, які є субстратами системи транспортерів L-амінокислот, а блокада системи транспорту L-амінокислот нівелює стимуляцію секреції соляної кислоти глутаміном або цистеїном [ ]. За відсутності гістаміну глутамін також стимулює вихід Н⁺. Ця амінокислота не збільшувала внутрішньоклітинний рівень Са²⁺, що вказує на те, що глутамін діяв на обкладові клітини не через Са²⁺-чутливі рецептори, з якими здатні зв’язуватись амінокислоти і також модулювати шлункову секрецію [ ]. Роботи Goo і співавт. [ ] свідчать, що глутамін, як і фенілаланін, впливають на внутрішньоклітинний обмін амінокислот, що в результаті призводить до активації Н⁺-К⁺-АТФази і стимуляції секреції соляної кислоти. Наші результати свідчать, що збільшення кислотності шлункового соку може бути результатом підвищення рівня глютамінової кислоти у шлунковому вмісті та активації її амідом системи 4F2-LAT2 транспортерів амінокислот і, як наслідок, перерозподілу їх спектру в обкладових клітинах, або Са²⁺-чутливих рецепторів на мембранах парієтальних гландулоцитів. Крім цього, на культурі клітин слизової оболонки шлунка щурів показано, що глутамат гальмує вивільнення соматостатину з Д-клітин [ ]. Оскільки останній є інгібітором шлункової секреції, то глутамат, таким чином, її стимулює. Відомо, що в шлунку глутамат взаємодіє зі специфічними рецепторами (T₁R₁/ T₁R₃ і mGluR_1-8), які розташовані на поверхні епітеліальних клітин і клітин шлункових залоз, а також активує аферентні волокна вагуса паракринним шляхом за допомогою NO і серотоніну [ ].

Через 2 місяця після індукції хронічного панкреатиту рівень глутамінової кислоти і треоніну мав тенденцію до збільшення, проте статистично достовірно не відрізнявся від контрольного (Табл.5).

Результати наших досліджень показали, що разом з треоніном та глутаміновою кислотою тенденцію до збільшення концентрації у шлунковому вмісті тварин з запаленням підшлункової залози має пролін та оксипролін. Так на 10 день від останньої інєкції L-аргініну вміст амінокислот підвищився на 23,9% (p<0,01), а на 63 день перевищував контрольні значення на 54,4% (p<0,001) (Табл.5).

Порівняльний аналіз рівня гліцину та аспаргінової кислоти у шлунковому вмісті щурів дослідної та контрольної групи, взятих на 10 та 63 добу від останньої інєкції L-аргініну, показав підвищений вміст зазначених амінокислот при хронічному некротичнимому панкреатиті. Так, на 10 день перебігу хвороби показники тварин з запаленням підшлункової залози перевищували контрольні значення на 15,9% (p<0,05), а на 63-й – на 22,2% (p<0,01) (Табл.5). Відомості літератури свідчать про протекторну роль гліцину при пошкодженнях слизової оболонки тонкого [] і товстого [] кишечника, покращення ним мікроциркуляції в печінковій паренхімі при експериментальному алкогольному панкреатиті [], регуляцію гомеостазу вільних радикалів [] та прояв антиоксидантних властивостей []. Аспарагінова кислота, подібно до глутамінової, задіяна в процесах знешкодження аміаку. В умовах нашого експерименту, вочевидь, функції гліцину та аспарагінової кислоти, рівень яких в секреті зменшувався, в шлунку частково виконують інші амінокислоти, зокрема глутамінова, міліграмвідсотковий вміст якої збільшувався.

Міліграмвідсотковий вміст орнітину, лізину та аргініну в шлунковому соці збільшився після 10 діб від початку індукції захворювання на 18,2% (p<0,05) (Табл.5). Лізин не утворюється в організмі ссавців, а орнітин та аргінін синтезуються переважно в печінці, тому, імовірно, ці амінокислоти не є продуктами метаболізму тканин шлунка. Вони з крові надходять до слизової оболонки, можливо, для покращення її трофіки. Введення аргініну викликає підвищення концентрації інсуліну в плазмі крові у котів []. Крім цього, в різних клітинах шлунка, в тому числі і залозистих, відбувається генерація оксиду азоту з L-аргініну. NO посилює кровотік у слизовій оболонці, що також активує її живлення і впливає на шлункову секрецію. Оскільки результати наших попередніх досліджень свідчать про гальмівну дію оксиду азоту на секрецію шлункових залоз [], можна припустити його часткову участь у зменшенні синтезу білків у слизовій оболонці шлунка щурів із хронічним панкреатитом. Певний відсоток амінокислот із тканин потрапляє у порожнину шлунка у незмінному вигляді та з часом, переважно з кишечника, всмоктується у кровотік. Через 2 місяця після індукції хронічного панкреатиту рівень орнітину, лізину і аргініну в шлунковому соці відновився до контрольних значень, знизившись на 18% (р<0,05) щодо такого на 10 добу перебігу патології (Табл.5).

Отримані нами результати показали, що на 10 добу після індукції панкреатиту концентрація валіну і тирозину в шлунковому вмісті щурів збільшувалась на 36,8% (р<0,01) (Табл.5). Оскільки тирозин гальмує шлункову секрецію, стимульовану гістаміном [], можна припустити, що в наших дослідах ця амінокислота пригнічувала секрецію ферментів. Відомості літератури останніх років свідчать, що підвищення рівня ароматичних амінокислот, зокрема тирозину, фенілаланіну та триптофану, в шлунковому соці вказує на малігнізацію тканин шлунка, а ці амінокислоти є біомаркерами для діагностики прихованого злоякісного переродження відповідних тканин []. Проте, в наших дослідах при збільшенні рівня тирозину спостерігалось зменшення концентрації фенілаланіну та лейцину на 21,4% (р<0,001), а міліграмвідсотковий вміст триптофану та ізолейцину не змінювався. На 63 добу після останньої ін’єкції L-аргініну концентрація валіну і тирозину в шлунковому вмісті знизилась на 23,1% (р<0,05) щодо такої на 10 добу перебігу патології і статистично достовірно не відрізнялась від контролю (Табл.5). При цьому рівень фенілаланіну і лейцину продовжував знижуватись (на 20% (р<0,05) щодо такого при попередньому вимірюванні та на 37,1% (р<0,001) щодо контролю, триптофану та ізолейцину також знизився на 37% (р<0,01) щодо контролю (Табл.5). Результати досліджень Nagata Y. і співавторів [] свідчать про підвищення рівнів L- і D-аланіну, серину, проліну і глутамату в шлунковому соці пацієнтів з карциномою шлунка на ранній стадії або інфекцією Helicobacter pylori. Проте в наших дослідах спостерігалось лише збільшення концентрації проліну та глутамінової кислоти, що не відтворює описану картину даної патології. Отже, ми можемо зробити висновок, що у щурів як на 10, так і на 63 добу перебігу хронічного некротичного панкреатиту не відбувається злоякісного переродження тканин шлунка.

Отримані нами результати узгоджуються з даними Girish B.N. і співавторів [], які досліджували зміни концентрацій вільних амінокислот в плазмі крові у пацієнтів із хронічним панкреатитом. Автори встановили, що рівні більшості амінокислот, зокрема серину, гістидину, аргініну, треоніну, тирозину, валіну, метіоніну, цистину, лейцину, ізолейцину та аспартату, в крові знижувались щодо такого у здорових людей, концентрації глутамату, гліцину, проліну та лізину збільшувались, а аланіну і фенілаланіну не змінювались. Напрямок змін рівня більшості із цих амінокислот у шлунковому вмісті наших піддослідних щурів співпадав з таким у плазмі крові пацієнтів за винятком аргініну, треоніну, тирозину та валіну, концентрації яких у шлунковому соці збільшувались, а гліцину, аланіну і фенілаланіну зменшувались. Характерною ознакою хронічного, як і гострого, панкреатиту можна вважати зниження рівня сірковмісних амінокислот як в крові людей, так і в шлунковому вмісті щурів. При хронічному панкреатиті у людей відзначалось зменшення концентрацій амінокислот із розгалуженими вуглецевими ланцюгами (валіну, лейцину, ізолейцину). Такі ж зміни, окрім рівня валіну, відбувались і в шлунковому соці наших щурів з експериментальною патологією. Автори встановили, що зменшення концентрацій амінокислот з розгалуженими вуглецевими ланцюгами у хворих на хронічний панкреатит пов’язано з розвитком у них діабету.

Таким чином, кислотність шлункового соку істотно збільшується на 10 добу перебігу хронічного некротичного панкреатиту, а концентрація загального білка зменшується як на 10, так і на 63 доби перебігу патології. Секрет шлункових залоз стає більш агресивним за рахунок збільшення кількості соляної кислоти в ньому, але травлення білків у шлунку при цьому погіршується. Разом з цим зменшується секреція слизу. Отже, слизова оболонка шлунка стає більш вразливою до дії соляної кислоти та інших, в тому числі і механічних, пошкоджуючих факторів. За умов хронічного панкреатиту змінюється співвідношення вільних амінокислот у шлунковому соці, що, імовірно, впливає на секрецію його основних компонентів та стан слизової оболонки шлунка. Підвищення рівня лізину, тирозину, треоніну, проліну, оксипроліну та глутамінової кислоти сприяє збереженню цілісності слизової оболонки шлунка, зменшує ризик розвитку запалення та виразкоутворення. На фоні зменшення концентрації гістаміну в порожнині шлунка значна стимуляція секреції соляної кислоти на 10 добу перебігу панкреатиту може відбуватись частково за рахунок збільшення концентрації глутамінової кислоти, а також залучення інших механізмів, зокрема опосередкованих парасимпатичним відділом автономної нервової системи. Пригнічення секреції білкових компонентів шлункового соку може бути викликане зниженням рівня сірковмісних амінокислот і збільшенням рівня тирозину та аргініну, який може гальмувати секрецію ферментів через посилення синтезу оксиду азоту.