shpargalka

20. Сайт-специфический механизм переключения типа флагеллина у Salmonella.Система, осуществляющая сайт-специфическую инверсию специального сегмента H (993 п.н.) в хромосоме S. typhimurium, ответственна за смену флагеллинов – жгутиковых антигенов этой патогенной для грызунов бактерии (рис. 1). После того как организм хозяина выработал антитела к антигену, который внесла заразившая его бактерия, в популяции ее потомков за счет переключения генов флагеллинов случайно возникают клетки с другим антигеном. Благодаря устойчивости к выработанному в зараженном организме антителу эти клетки начинают размножаться и обеспечивают новую волну инфекции. Таким образом, переключение генов при инверсии специального сегмента хромосомы имеет приспособительное значение. Схема регуляции генов флагеллинов у Salmonella typhimurium. Регуляция генов флагеллинов осуществляется путем инверсий сегмента H. Сегмент несет ген инвертазы hin с собственным промотором, не показанным на рисунке, и с промотором P (выделен красным цветом), общим для гена флагеллина H2 и гена rH1, кодирующего репрессор гена H1. Ген флагеллина H1 находится в другом районе хромосомы и имеет собственный оператор О и промотор P. На верхнем рисунке гены rH1 и H2 состыкованы со своим промотором и экспрессируются. Продукт гена rH1 подавляет ген H1, в результате синтезируется только флагеллин H2. На нижнем рисунке представлен результат инверсии сегмента Н. Промотор генов rH1 и H2 отворачивается от них (экспрессия генов прекращается), и ничто не препятствует синтезу флагеллина H1. Волнистые стрелки показывают транскрипты генов. Стрелка, ведущая от белка-репрессора к оператору гена H1, изображает репрессию этого ген.

22. Рекомбинация при трансформации хромосомной ДНК у бактерий. Ген рекомбинацию называют сайт-специфичной, если обмен между разными молекулами ДНК осуществляется только в участках со строго определенными нуклеотидными последовательностями,, если в любых местах молекулы ДНК - сайт-неспецифичной. Трансформация перенос генетического материала, заключающийся в том, что бактерия-реципиент захватывает из внешней среды фрагменты чужеродной ДНК. Трансформация может быть спонтанной или индуцированной. Индуцированная трансформация происходит при добавлении к культуре бактерий очищенной ДНК, полученной из культур тех бактерий, генетические признаки которых стремятся передать исследуемой культуре. Спонтанная трансформация происходит в естественных условиях и проявляется в возникновении рекомбинантов при смешивании генетически различающихся клеток. Она протекает за счет ДНК, попадающей в окружающую среду вследствие лизиса клеток или в результате ее активного выделения жизнеспособными клетками-донорами. В процессе трансформации происходят значительные изменения поверхностных слоев клетки, которые способствуют поглощению ДНК. Аутолитические ферменты клетки растворяют клеточную стенку в тех участках, где происходит ее синтез. При этом мезосомы через образовавшиеся отверстия соприкасаются с внешней средой, адсорбируют и втягивают внутрь клетки трансформирующую ДНК, где она и вступает в рекомбинацию с ДНК реципиента. В результате этого образуется мерозигота. Клетка делится, и ее потомки наследуют признаки, полученные от донора и реципиента. Однако в других случаях поглощенные фрагменты ДНК разрушаются нуклеазами клетки-реципиента и трансформации не происходит. Эффективность спаривания трансформирующих ДНК с гомологичным участком хромосомы реципиента зависит от гомологии ДНК донора и реципиента. Чем больше гомология, тем эффективнее спаривание, что определяет конечный результат трансформации, т.е. количество формирующихся рекомбинантов. Трансформировать могут признаки: устойчивость и чувствительность к антибиотикам, способность к синтезу ферментов и т.д. Как правило, при трансформации изменяется один какой-либо признак. сайт-специфическая рекомбинация умеренного бактериофага лямбда. После инфекции в клетку Е. coli линейная вирионная двуцепочечная ДНК фага замыкается в кольцо за счет имеющихся на ее концах комплементарных одноцепочечных последовательностей. Интеграция происходит путем рекомбинации между особыми att (attachment)-сайтами: attP в хромосоме фага и attB в хромосоме бактерии. Профаг фланкирован рекомбинантными сайтами attL (левый) и attR (правый). Для катализа этой реакции необходимы четыре субъединицы интегразы, связанные в att-сайтах. Сайты attP. Размере около 270 п.н. он состоит из центральной части О и двух примыкающих к ней частей: Р и Р'. Внутри сайта attP располагаются участки связывания с интегразой и белками IHF и Xis. Сайт attB устроен проще. Его размер всего 23 п.н., гомология с attP ограничена центральной частью из 15 п.н., в которой имеются два сайта связывания с интегразой. Вырезание (эксцизия) профага из хромосомы происходит в обратной последовательности событий. В интегративной рекомбинации участвуют сайты attP и attB, продукт фагового гена int (интеграза) и белок IHF (Integration Host Factor) E. coli. Для эксцизии необходимы сайты attL и attR, те же белки и еще продукт фагового гена xis. Делает разрыв в одной цепи каждого дуплекса, и в месте разрыва образуются З'-Р и 5'-ОН-концы ДНК.Фермент ковалентно связывается с З'-Р-концом, благодаря чему энергия разорванной фосфодиэфирной связи сохраняется. Комплекс интегразы с attP-сайтом и белком IHF (Integration Host Factor) формирует сложно уложенную нуклеопротеидную структуру, которая захватывает сайт attB. В этой структуре att-сайты связываются за счет взаимодействий между субъединицами интегразы и затем подвергаются согласованному расщеплению. Интеграза делает разрыв в одной цепи каждого дуплекс.а, и в месте разрыва образуются З'-Р и 5'-ОН-концы ДНК.

25. 26. Основные механизмы гомологичной рекомбинации у прокариот. Rec-мутанты и их свойства. На начальной стадии исследований в лаборатории А. Кларка в США был выделен и изучен набор мутантов с нарушениями рекомбинации (у них была подавлена способность давать рекомбинантное потомство при конъюгации и трансдукции). СВОЙСТВА REC- МУТАНТОВ. Нарушена способность к рекомбинации в той или иной степени. У большинства нарушена способность к репарации повреждений в ДНК. У некоторых мутантов снижается жизнеспособность. Некоторые мутации приводят к увеличению частоты мутагенеза. С помощью этих мутантов, названных rec, были установлены соответствующие гены, а затем выделены рекомбинационные белки, инактивированные у мутантов. Изучение Rec- мутантов позволило выявить ферменты, осуществляющие процесс гомологичной рекомбинации. МУТАЦИЯ rec A E. Coli. Первая мутация. Получена Кларком и Маргулис в 1965 г. Полностью подавлена рекомбинация. Резко повышена чувствительность к ДНК-повреждающим агентам. С помощью этих мутантов, названных rec, были установлены соответствующие гены, а затем выделены рекомбинационные белки, инактивированные у мутантов. В условиях in vitro для проявления всех активностей белка RecA требуются в качестве ко-факторов АТФ и одноцепочечная ДНК в любой форме, например дуплексная ДНК с концевыми (хвосты) или внутренними (бреши) одноцепочечными участками. Основное назначение белка RecA — приводить во взаимодействие одноцепочечную ДНК с гомологичным дуплексом. Имеет массу 37 973 D. Содержится в количестве от 1000 до 10000 молекул. Его количество возрастает в 50 раз после УФ-облучения. Обладает рядом активностей, которые необходимы для рекомбинации. Может связываться с он и днДНК, образуя длинные филаменты. Это позволяет ему встраивать онДНК в гомологичный район днДНК, замещая и вытесняя одну нить из дуплексной молекулы. Связывание RecA белка идет предпочтительно в одном направлении и носит кооперативный характер. Молекулы белка собираются на ДНК по принципу "конец-в-конец", образуя вокруг ДНК правозакрученную белковую спираль. В результате возникает нитевидное образование — RecA-ДНК-филамент. Белок RecA имеет два сайта связывания с ДНК. Первый сайт используется для первичного связывания с ДНК: в присутствии АТФ белок всегда взаимодействует в этом сайте с одноцепочечной ДНК. Второй необходим для обнаружения комплементарности. Взаимодействие филамента с ДНК осуществляется за счет второго сайта связывания RecA. Филаменты могут вступать в рекомбинацию только с "голой", не находящейся в филаменте ДНК. Два филамента не рекомбинируют друг с другом. Связывание с ДНК во втором сайте слабое. Из-за этого между филаментом и ДНК возникают лишь кратковременные контакты (соударения). Эти контакты становятся прочными только после встречи гомологичных последовательностей. Нахождение гомологии связано с формированием гетеродуплекса. Обычно оно начинается с образования структуры, в которой задействованы три цепи ДНК и которая называется D-петлей (от англ, displacement loop — петля вытеснения). D-петля может быть закрытой, если в дуплекс внедряется одноцепочечный хвост, или открытой, если она формируется на конце линейного дуплекса. РЕАКЦИЯ ЗАМЕЩЕНИЯ НИТИ. одноцепочечная ДНК внедряется в дуплекс и образует двойную спираль (гетеродуплекс) с одной, комплементарной ей цепью дуплекса, одновременно вытесняя вторую цепь. В зависимости от структуры ДНК-субстратов белок может проводить разные рекомбинационные реакции.

в условиях in vitro белок RecA способен осуществлять поиск гомологии, формировать синаптическую структуру на основе гетеродуплекса и производить обмен цепями между гомологами. Эти реакции стимулируются добавлением белка SSB, который выпрямляет одноцепочечную ДНК. ДРУГИЕ АКТИВНОСТИ Rec A БЕЛКА. 1. Обладает АТФазной активностью, что позволяет работать ему как мотору. 2. При большом числе повреждений в ДНК приобретает протеазную активность. Эта специфическая протеаза, которая расщепляет Lex-репрессор и репрессор фага лямбда. ОСНОВНОЙ ПУТЬ РЕКОМБИНАЦИИ У Е. COLI — RECBCD. Фермент RecBCD-нуклеаза, субъединицы которой кодируются генами recВ, recС и recD. Мутации в генах rec B rec C на 90% снижают частоту рекомбинации и повышают чувствительность к повреждениям в молекуле ДНК. RecBCD-нуклеаза — один из самых ранних белков рекомбинации. Она готовит субстрат для белка RecA. Экзонуклеазная. RecBCD может гидролизовать одно- и двуцепочечную ДНК, притом с обоих концов. Активности: Хеликазная (расплетает дуплекс ДНК, затрачивая на это энергию АТФ). Как сайт-специфическая эндонуклеаза: расщепляет одноцепочечную ДНК около особой 8-нуклеотидной последовательности 5'-GCTGGTGG-3', называемой Chi-сайтом. ГЕНЫ rec B rec C rec D. Кодируют субъединицы АТФ-зависимой ДНКазы, или экзонуклеазы V. Rec B Обладает 5’-3’ геликазной активностью. Rec C распознает chi-последовательность 5'-GCTGGTGG-3'. Rec D обладает 3’-5’ геликазной активностью. СХЕМА РАБОТЫ ФЕРМЕНТА. Фермент атакует конец дуплекса и начинает расплетать его. Реакция асимметрична, что проявляется в особой роли цепи ДНК с З'-концом. RecBCD удерживает его таким образом, что образуется одноцепочечная петля примерно в тысячу нуклеотидов длиной, тогда как 5'-цепь выступает в виде свободного хвоста. Продолжая расплетать дуплекс, RecBCD-нуклеаза сохраняет петлю в З'-цепи и продвигает ее вдоль дуплекса. Поскольку после прохождения фермента комплементарные цепи ренатурируют ("схлопываются"), в 5'-цепи автоматически возникает вторая петля. Двойная петля продвигается вдоль дуплекса до тех пор, пока фермент не встретит Chi -сайт в З'-цепи. Фермент должен подойти к Chi-сайту справа, с З'-стороны. На расстоянии 4—6 нуклеотидов до него RecBCD разрывает З'-цепь. Дальнейшее расплетание дуплекса приводит к вытеснению рекомбиногенного одноцепочечного З'-конца, который связывается с белком RecA (рис). На З'-конце сначала формируется филамент, затем образуется D-петля (закрытая, так как возникает в кольцевой хромосоме). Затем D-петля разрезается с помощью одной из эндонуклеаз Е. coli, что приводит к полухиазме Холлидея. ДНК-полимераза и ДНК-лигаза должны залечить брешь и разрывы в цепях. Миграцию ветвления и разрешение полухиазмы осуществляют другие белки. RuvA, RuvB и RuvC — продукты генов ruvA, ruvB и ruvC. RuvA узнает крестообразную полухиазму и нацеливает на нее RuvB. RuvB узнает комплекс RuvA—полухиазма и, используя энергию АТФ и работая как ДНК-хеликаза, осуществляет миграцию полухиазмы в том же направлении, что и RecA-белок in vitro, но гораздо эффективнее. Резолваза RuvCузнает комплекс RuvB—полухиазма, связывается с ним и в определенный момент разрешает полухиазму

27. Подвижные генетические элементы, их структура. Свойства мобильных генетических элементов. МГЭ обнаружены у самых разных организмов: у бактерий, дрожжей, растений и животных. МГЭ, выделяемые у разных видов, существенно отличаются по длине нуклеотидной последовательности и, свойствам. У дрозофилы, хорошо изученной в этом отношении, описано около десяти типов мобильных элементов, одни из которых похожи друг на друга, иные резко отли­чаются. Количество копий, содержащихся в одном геноме, колеблется для разных мобильных элементов до 1000. Длина нуклеотидной последовательности мобильных эле­ментов варьирует в широких пределах, от 1 тыс. до 10 тыс. пар нуклеотидов. Наличие на концах длинных концевых повторов — типичная черта строения мобильных элементов. Способы перемещения. Существует, вероятно, не менее двух способов перемещения мобильных генетиче­ских элементов. Первый из них связан с «вырезанием» мобильного элемента в одном месте хромосом и встройкой его в другом месте - транспозиции. Такие перемещения, по-видимому, имеют обычно случайный, ненаправленный характер. Другой тип событий представляет собой направленные перемещения генетических элемен­тов. В этом случае в исходном положении мобильный элемент сохраняется, но появляется и в новом, хотя и вполне определенном месте. Таким образом, в данном случае речь идет о появлении дополнительной копии мобильного элемента. Для этого необходимо удвоение молекулы ДНК данного мобильного элемента и его по­следующее встраивание в опреде­ленное место генома. Роль мобиль­ных генетических элементов еще предстоит тщательно изучить. Одна­ко в отдельных случаях уже имеется ясность. Так, Б. Мак-Клинток показала, что встраивание мобильного элемента рядом с геном, контроли­рующим окраску семян у кукурузы может включать этот ген. В резуль­тате окраска зерен изменяется, например с красной на белую. она предсказала существование мобильных элементов в каком-либо гене или в непосред­ственной близости от него, что мо­жет приводить к резким наследуемым изменениям его состояния, т. е. по существу к появлению мутации. В последнее время стало ясно, что многие давно известные и хорошо изученные точечные мутации у дрозофилы, мыши и других организмов в действительности представляют собой результат встраивания или вырезания мобильных генетических элементов. 45% генома – подвижные (мобильные, или мигрирующие) элементы (ПЭ). Биологическая роль ПЭ. Проявляются как в онто-, так и в филогенезе. Горизонтальный перенос устойчивости к антибиотикам, лекарствам, ядам – у бактерий. Мутации генов за счет включения ПЭ в кодирующую часть генов. Вмешательство в работу клеточных генов – изменение их активности (рак). Перестройки хромосом, перенос генов и целых наборов генов в пределах одного генома и из одного генома (напр., вируса) в другой (хозяина). Стабилилизация концов хромосом у дрозофил. Рисунок -структурная организация некоторых подвижных элементов. Прямоугольники, ограниченные синими линиями, изображают центральные части элементов, красными - обращенные концевые повторы бактериальных подвижных элементов или длинные прямые концевые повторы ретротранспозона. Прямоугольники, ограниченные зелеными линиями, - прямые повторы ДНК-мишени, зеленые линии - часть ДНК-мишени, в которую встроен подвижный элемент. Направление красных и зеленых треугольников указывает ориентацию соответствующих повторов. Стрелки над подвижным элементом -направление транскрипции генов. а - бактериальный транспозон Tn3. Размер около 5 т.п.н., обращенные концевые повторы по 38 п.н., прямые повторы ДНК-мишени по 5 п.н., tnpA - ген транспозазы, tnpR - ген резолвазы. Участки начала транскрипции этих генов перекрываются в рекомбинационном сайте RS (сайте разрешения коинтегратов для резолвазы), выделенном синим. bla - ген бета-лактамазы, определяющий устойчивость к антибиотикам пенициллинового ряда; б - бактериальный транспозон Tn5. Размер около 5,8 т.п.н., обращенные концевые повторы представлены подвижным элементом IS50 длиной 1531-1533 п.н. Левый повтор (IS50L) инактивирован в результате нонсенс-мутации, правый повтор (IS50R) кодирует транспозазу. NPTII - ген неомицинфосфотрансферазы II обеспечивает устойчивость к антибиотику канамицину. Прямые повторы ДНК-мишени по 9 п.н.; в - дрожжевой ретротранспозон Ty1. Размер около 5,9 т.п.н., прямые концевые повторы по 330 п.н., прямые повторы ДНК-мишени по 5 п.н. С центральной части элемента, включая значительную часть его концевых повторов, считывается единый транскрипт. Ген gag кодирует структурный РНК-связывающий белок. Ген pol кодирует общий белок, который содержит в качестве доменов интегразу (INT), обратную транскриптазу (RT), РНКазу H (RH) и протеазу (PR). Последняя затем разрезает общий белок на отдельные ферменты.

30. Подвижные генетические элементы эукариот. Подвижные элементы эукариот представлены отдельными семействами, сходными по своей структуре и поведению. Внутри семейства различают подсемейства идентичных или очень сходных подвижных элементов, число которых колеблется от нескольких копий до нескольких тысяч копий на геном. В целом подвижные элементы обычно составляют 10-30% всей массы ДНК. У растений, как недавно выяснилось, подвижные элементы составляют более половины ДНК по весу. Подвижные элементы обычно рассеяны по геному, но в отдельных участках хромосом они могут концентрироваться. Открытие подвижных элементов нисколько не посягает на классические представления хромосомной теории наследственности о стабильном расположении генов по длине хромосом. Перемещения подвижных элементов - это достаточно редкие события: у бактерий один акт перемещения обычно удается зарегистрировать примерно на десять тысяч - один миллион клеток (частоты перемещений сильно варьируют). Частоты транспозиций у дрозофилы настолько малы, что их трудно заметить и оценить. Только в особых ситуациях, вызванных внешними воздействиями или мутациями генов хозяина или самих подвижных элементов, частоты перемещений могут резко (на два-три порядка) увеличиваться, достигая, например, у дрозофилы одного события на 10-100 особей за поколение. Различают два основных класса подвижных элементов: транспозоны и ретротранспозоны. Такая классификация основана на молекулярных механизмах, с помощью которых перемещаются подвижные элементы. Транспозоны перемещаются с участием комплекса белков, обеспечивающего активность фермента транспозазы, которая узнает элемент и обеспечивает его перенос на новое место. Транспозоны ограничены с двух сторон так называемыми инвертированными повторами, то есть последовательностями, направленными навстречу друг другу. Инвертированные повторы необходимы для перемещения элемента, которое осуществляется благодаря их сближению друг с другом и узнаванию транспозазами. Инвертированные повторы сближаются и точно отрезаются от соседних участков ДНК хозяина. Успешному вырезанию элемента способствует дополнительная сверхспирализация двухнитевой спирали ДНК, обеспечивающая изгибы двойной спирали и сближение отдельных ее участков. Вырезанный транспозон внедряется в район вносимого транспозазой разрыва в молекуле-мишени и сшивается с ДНК хозяина в новом месте. Разрыв и зашивание осуществляются транспозазой и вспомогательными белками. Транспозаза может кодироваться как самим подвижным элементом, который будет перемещаться, так и другой копией элемента, локализованной в том же геноме в отдалении. подвижность элементов становится возможной благодаря активности ферментов, которые способны точно вырезать элемент из хромосомы для того, чтобы затем вставить его в какое-то другое место генома. Брешь в ДНК, оставляемая после вырезания транспозона, может залечиваться - застраиваться с участием гомологичного участка, например сестринской, только что редуплицированной молекулы ДНК. Осуществляются комплементарные взаимодействия нитей в гомологичных участках ДНК, соседствующих с транспозоном, затем происходит достройка - синтез комплементарных нитей, после чего образовавшаяся структура разрезается, а участки новосинтезированной ДНК, содержащие материал ДНК транспозона, сшиваются с "желтыми" или "красными" флангами. В итоге залечивается дырка на месте вырезанного транспозона, а число копий транспозона увеличивается на одну копию. Бактериальный транспозон кроме гена транспозазы может содержать ген, обеспечивающий устойчивость бактерии к тому или иному антибиотику - пенициллину, тетрациклину и др. Другой большой класс подвижных элементов - это ретротранспозоны, они не умеют вырезаться из хромосомы, как это делают транспозоны. Механизм их перемещения основан на существовании открытой в 1970 году Г. Теминым и Д. Балтимором реакции обратной транскрипции - синтеза нити ДНК на РНК. Химическая реакция протекает так же, как при образовании нити комплементарной ДНК на ДНК-матрице при репликации двухнитевой молекулы ДНК. Обратная транскрипция была обнаружена при изучении ретровирусов, содержащих РНК, которвя служит матрицей при образовании ДНК-копии РНК вируса. Фермент, осуществляющий эту реакцию синтеза ДНК на РНК, называют обратной транскриптазой или ревертазой. Ревертаза не только ведет синтез нити ДНК на РНК, но и осуществляет синтез второй комплементарной нити ДНК, а РНК-матрица распадается и удаляется. Двухнитевая ДНК синтезируется в цитоплазме, а затем перемещается в ядро и может встроиться в геном, образуя провирус. Находясь в хромосоме, провирус стабильно наследуется в ряду поколений как обычный ген. В хромосомах млекопитающих содержатся так называемые эндогенные провирусы, которые безвредны, а может быть, даже несут какие-нибудь биологические функции. Провирус ограничен так называемыми длинными концевыми повторами (ДКП), содержащими обычно по 250-700 нуклеотидных пар. Они необходимы для транскрипции провируса и его репликации (воспроизведения). Левый повтор содержит промотор, с которым взаимодействует РНК-полимераза, начинающая синтез РНК. Синтезированная молекула РНК, равно как и РНК из вирусной частицы, заразившей клетку, транслируется с образованием белков-ферментов, необходимых для синтеза ДНК провируса и его внедрения в геном, а также белков самой вирусной частицы. В некоторых случаях может образоваться зрелый вирус, содержащий РНК, упакованную в белковую оболочку. Вирусная частица может выйти из одной клетки и заразить другие. Для встраивания (интеграции) ДНК провируса необходим фермент интеграза, разрезающий ДНК-мишень и сходный по механизму своего действия с транспозазой. Наличие ДКП не только обеспечивает транскрипцию, но и полноценную репликацию провируса с двумя ДКП. Может случиться, что в процессе обратной транскрипции и репликации ДНК в состав будущего провируса случайно попадет материал других клеточных генов, если, например, ревертаза будет копировать какие-либо клеточные РНК. Ревертаза работает неточно, она может вносить ошибки в нуклеотидную последовательность ДНК, образующуюся на РНК, в отличие от ДНК-полимеразы, работающей почти безошибочно при воспроизведении всех хромосом. Если такая ошибочно скопированная последовательность, соответствующая некоторым важным генам, управляющим размножением клеток, попадет в состав провируса и, следовательно, в геном клетки, то это событие может привести к злокачественному перерождению клетки, поскольку клетка теперь будет нести ген, кодирующий измененный белок, отвечающий за рост и размножение клеток. Поэтому ретровирусы, несущие протоонкогены, опасны для клетки и организма. Структуру провирусов практически повторяют подвижные элементы, получившие название ретротранспозонов. Ретротранспозоны широко распространены у эукариот, населяя геномы дрожжей, растений, насекомых и позвоночных, включая человека. По-видимому у растений они могут занимать значительную часть межгенных пространств. Процесс синтеза ДНК при размножении ретротранспозона с участием ревертазы происходит в вирусоподобных частицах, белковые компоненты которых также кодируются генами ретротранспозона. Однако такие частицы неинфекционны, поскольку большая часть ретротранспозонов в отличие от ретровирусов не содержит гена, который мог бы кодировать белок оболочки вирусной частицы, обеспечивающей ее выход из клетки и способность к заражению других клеток. Правда, резкой границы между ретротранспозонами и ретровирусами провести нельзя. Так, один из ретротранспозонов плодовой мушки дрозофилы (gypsy - цыган) можно назвать как недавно оказалось, настоящим ретровирусом: путем инъекции или скармливанием вирусных частиц удается заразить мух, не несущих ретротранспозона. В то же время этот ретротранспозон в одной определенной линии мух является лишь внутригеномным наследуемым в ряду поколений элементом, локализация нескольких его копий неизменна в одной линии мух, но различается в разных линиях. Подавляющая часть ретротранспозонов либо потеряла ген оболочки, либо еще не приобрела его и, следовательно, представляет собой исключительно внутригеномные, неинфекционные элементы, способные лишь к самовоспроизведению и "подзаражению" того же генома. Другой большой класс ретротранспозонов не несет длинных концевых повторов. Механизм внедрения таких ретротранспозонов в ДНК иной, хотя он также осуществляется с помощью обратной транскрипции. К числу таких ретротранспозонов относятся представители так называемого семейства L1, населяющие геном человека. Если репликация ретротранспозонов с ДКП не зависит от точки будущей инсерции, то репликация элемента без длинных концевых повторов непосредственно сопряжена с районом будущего внедрения ретротранспозона. РНК, образовавшаяся при транскрипции ретротранспозона, перемещается к достаточно случайному месту разрыва ДНК-мишени, причем в ряде случаев показано, что она даже сшивается с одной из нитей ДНК. Сюда же устремляются и необходимые для интеграции белки - ревертаза и интеграза. Другая, комплементарная нить ДНК служит затравкой для копирования РНК-копии элемента с участием ревертазы. Сначала ревертаза копирует небольшой участок ДНК-мишени, а затем меняет матрицу и копирует РНК. Затем РНК удаляется и образуется вторая комплементарная нить ДНК. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ РЕТРОТРАНСПОЗОНОВ В ГЕНОМЕ ЭУКАРИОТ Ретротранспозоны и проблема сохранения концов хромосом в ряду поколений. При воспроизведении ДНК перед клеточным делением синтез ДНК начинается с образования затравки РНК, поскольку фермент ДНК-полимераза способен только добавлять дезоксирибонуклеотидные звенья к 3'-концу полинуклеотидной цепи, но неспособен начинать синтез цепи ДНК. Затравка затем удаляется, и бреши застраиваются. Однако на одном из концов реплицирующихся молекул останется брешь, которую не удается заделать с помощью ДНК-полимеразы, работающей в 5'-3' направлении. Возникает опасность, что одиноко выступающий однонитевый конец ДНК будет уничтожен каким-либо ферментом, в результате чего молекула укоротится с конца. Если не принять соответствующих мер, то при каждом акте репликации ДНК хромосома будет укорачиваться с концов. В конечном итоге могут быть утрачены важные гены и клетка погибнет. Обычно для сохранения конца ДНК используется фермент теломераза, состоящий из двух компонентов: белка и РНК-матрицы, с помощью которой удлиняется конец ДНК. Такое удлинение возможно, потому что концы хромосом содержат повторы из нескольких нуклеотидов, которым комплементарен участок РНК - компонента теломеразы. Таким образом, теломераза узнает выступающий 3'-конец и удлиняет его. В таком случае удается, снова с использованием ДНК-затравки и РНК-матрицы, достроить конец ДНК. Одна из причин старения видится в том, что при отсутствии теломеразы в некоторых тканях происходит укорачивание хромосомы с потерей важных генов. Наоборот, бессмертие ряда клеток в культуре вне организма, свойственное, как правило, клеткам из опухолей, объясняется реактивацией теломеразы. У дрозофилы отсутствует теломеразная машина, но концы ДНК удлиняются за счет перемещений ретротранспозонов. На этом примере впервые показана важная структурная и функциональная роль ретротранспозонов. Они выступают как компоненты генома, спасающие хромосому от укорачивания. В качестве спасателей выступают ретротранспозоны, относящиеся к семействам, без длинных концевых повторов. Ретротранспозоны перемещаются, образуя повторяющуюся структуру, в которой элементы соединены друг с другом по типу "голова к хвосту". Сначала на РНК-транскрипте как на матрице с помощью ревертазы строится комплементарная нить ДНК, а затем после удаления РНК-матрицы достраивается другая. Таким образом, если эти ретротранспозоны и существовали когда-то как элементы-паразиты, то впоследствии геном хозяина приспособил их для выполнения столь важной функции, как сохранение концевых участков хромосом. Эти ретротранспозоны стали уже не эгоистами, а бесценными помощниками, спасающими хромосому от потери генов. Ретротранспозоны залечивают двухнитевые разрывы ДНК. Повреждения одной из комплементарных нитей ДНК могут быть устранены за счет удаления этого участка и его ресинтеза с использованием неповрежденной комплементарной нити ДНК. Сложнее залечить двухнитевой разрыв, приводящий к образованию двух отдельных фрагментов двойной спирали ДНК. Хромосомы регулярно расходятся по дочерним клеткам, если они не потеряли центромеры, к которой прикрепляются нити веретена деления, растаскивающие хромосомы. Однако фрагмент хромосомы, лежащий от центромеры дальше, за разрывом, будет утрачен. Обычно двухнитевой разрыв залечивается с помощью гомологичной молекулы ДНК, например сестринской, только что реплицированной нити. Этот процесс осуществляется путем ресинтеза копии утраченной ДНК на месте образовавшейся дырки. Однако если клетка лишена обычной системы залечивания двухнитевого разрыва, то в качестве заплатки может быть использована подвижная ДНК. в роли такой подвижной ДНК может выступать реплицирующаяся ДНК ретротранспозонов. В этом случае спасательную функцию осуществляет класс ретротранспозонов, содержащих ДКП. Заплатка позволит хромосоме сохранить целостность и не утратить концевого фрагмента. Правда, брешь в двухнитевой спирали ДНК будет залеплена заплаткой из ретротранспозона, то есть исходная нуклеотидная последовательность не будет восстановлена. Однако если район разрыва не содержал существенного гена, то клетка, а возможно, и организм сохранят жизнеспособность. Поврежденные неактивные подвижные элементы. существовует множества неактивных дефектных копий подвиж. элементов. Очень часто отдельные копии транспозонов или ретротранспозонов оказываются дефектными, то есть они не способны кодировать транспозазу или ревертазу. Однако такие элементы сохраняют способность к перемещениям, если в случае транспозонов не повреждены инвертированные повторы, узнаваемые транспозазой, а в случае ретротранспозонов сохранены промотор и возможность транскрипции элемента. Множество таких дефектных копий сохранит способность к перемещениям, если ферменты, ответственные за перемещения (ревертазы и транспозазы) будут кодироваться другими полноценными элементами. В геноме человека источником активной ревертазы является, по-видимому, так называемый ретротранспозон L1, число копий которого достигает 100 тыс. Однако число активных перемещающихся копий составляет всего 30-60 тыс., тогда как остальные настолько повреждены, что не транскрибируются и, следовательно, уже не могут перемещаться. перемещения L1 в геноме человека вызывают мутации генов. существуют как полноценные активные элементы, так и дефектные, способные перемещаться только при участии полноценных копий. Наконец, отдельные копии могут быть настолько изменены, что утратят всякую способность к перемещению из-за того, что концевые повторы будут безнадежно испорчены: станет невозможной как транскрипция, так и узнавание транспозазами.