shpargalka

33. Генетические эффекты, вызываемые подвижными элементами у прокариот и эукариот: изменения экспрессии генов, генные мутации, хромосомные перестройки, гибридный дисгенезиз. См. 30-32.

35. Сайт-специфический механизм перестройки иммуноглобулиновых последовательностей ДНК у позвоночных. Незаконная рекомбинация – это сборная группа процессов, где рекомбинация происходит без гомологии между молекулами ДНК, и при этом без участия механизмов сайт-специфической рекомбинации или транспозиций. В качестве примеров можно привести захват ретровирусом некоторых клеточных генов при его эксцизии из хромосомы хозяйской клетки, а также интеграцию фрагментов ДНК, вводимых в клетки позвоночных с помощью микроинъекций. Механизмы незаконной рекомбинации малоизучены. Общим для них является соединение концов негомологичных молекул ДНК. Впервые механизм одной из реакций незаконной рекомбинации был описан японским исследователем Х. Икедой с сотрудниками в 1982 году. В опыте in vitro эти авторы продемонстрировали рекомбинацию между полностью негомологичными ДНК плазмиды pBR322 и фага лямбда, катализируемую высокоочищенной топоизомеразой II (ДНК-гиразой) E. coli. Согласно модели, предложенной авторами, две молекулы гиразы, каждая из которых состоит из двух пар субъединиц, временно разрывают в обеих молекулах обе цепи ДНК, удерживая их концы. Затем они обмениваются парами субъединиц вместе с удерживаемыми концами разных ДНК-партнеров и сшивают концы дуплексов. Позднее Икеда показал такую рекомбинацию и in vivo в клетках E. coli. К настоящему времени накоплены данные об участии топоизомераз обоих типов в незаконной рекомбинации у бактерий и эукариот. В последнее десятилетие у амфибий и млекопитающих обнаружены ферменты, связывающие двуцепочечные концы ДНК независимо от их гомологии. Природа этих белков до последнего времени оставалась неясной. Сенсационный прорыв в данной области возник в 1994-1995 годах в результате исследования мутантов грызунов, проявляющих повышенную по сравнению с нормальными особями чувствительность к ионизирующим излучениям. Известно, что ионизирующие излучения вызывают двуцепочечные разрывы ДНК, то есть разрывы хромосом, для залечивания которых в нормальной клетке существуют специальные системы репарации. У мутантов они нарушены. Кроме того, у мутантов оказалась подавленной и интеграция в хромосомы фрагментов ДНК, искусственно введенных в клетки. Это неудивительно, поскольку у млекопитающих в основе процессов как интеграции чужеродной ДНК, так и репарации двуцепочечных разрывов лежит соединение концов разорванных двуцепочечных ДНК, обходящееся без гомологии, то есть оба процесса осуществляются по механизму незаконной рекомбинации (в отличие от дрожжей и бактерий, у которых они основаны на гомологичной рекомбинации). Неожиданным оказался тот факт, что мутанты проявили неспособность к рекомбинационным перестройкам в кодирующих иммуноглобулины последовательностях ДНК, а это означает, что незаконная рекомбинация играет важную роль и в этих перестройках. Таким образом, было выяснено, что в рекомбинации иммуноглобулиновых последовательностей ДНК задействованы два разных механизма. Ранние этапы – образование сайт-специфических двуцепочечных разрывов происходят по типу сайт-специфической, а поздние – воссоединение концов разрывов – по механизму незаконной рекомбинации. Выявлен и фермент, ответственный за такую незаконную рекомбинацию: указанные выше радиочувствительные мутанты оказались дефектными по ДНК-зависимой протеинкиназе. Фермент активируется, связываясь со свободными концами ДНК независимо от их происхождения, и соединяет эти концы. Нетрудно заметить, что незаконная рекомбинация, подобно сайт-специфической рекомбинации и транспозициям, может приводить к хромосомным перестройкам. В живой клетке разрывы хромосом, являющиеся одним из источников незаконной рекомбинации, могут спонтанно возникать в ходе репликации, транскрипции и репарации ДНК. Однако нельзя исключить возможность того, что произвольное комбинирование разорванных концов эукариотической хромосомы может ограничиваться структурной организацией хроматина, фиксирующей эти концы.

36. Нестабильные мутации кукурузы как пример запрограммированной рекомбинации. Летом 1944 года в лаборатории Колд Спринг Харбор Мак-Клинток начала проведение систематических исследований мозаицизма семян кукурузы и механизмов его изменчивого наследования. В одной из линий кукурузы в мейозе она наблюдала регулярные разрывы и воссоединения хромосом в области короткого плеча 9-й хромосомы. На дистальном конце этой хромосомы был расположен узелок гетерохроматина, недалеко от него по направлению к центромере локализовались рецесссивные мутации генов. Мак-Клинток выделила два новых доминантных взаимодействующих локуса: Диссоциатор (англ. Dissociator, Ds) и Активатор (англ. Activator, Ac). Она обнаружила, что диссоциатор не только вызывает разрыв хромосом и вызывает нестабильные мутации, но в присутствии активатора по-разному воздействует на соседние гены. В начале 1948 года она сделала интересное открытие — как с диссоциатором, так и активатором может происходить транспозиция, то есть они способны менять своё положение на хромосоме. Эффект транспозиции Ac и Ds выражался в изменении окраски зёрен кукурузы относительно образцов из поколений от контрольного скрещивания. Мак-Клинток описала взаимосвязь между локусами, использовав микроскопический анализ. Она сделала вывод о том, что Ac контролирует транспозицию Ds в 9-й хромосоме, и перемещение Ds сопровождается разрывом хромосомы. Во время своего движения Ds перестаёт подавлять ген цвета алейронового слоя, последний переходит в активную форму, что вызывает синтез пигмента в клетках. Поскольку транспозиция Ds в разных клетках происходит по-разному, это приводит к мозаицизму. Размер пигментировавших областей на зёрнах зависит от степени развития зерна на момент диссоциации.

В 1948-1950 годах Мак-Клинток разрабатывала теорию, согласно которой мобильные элементы влияют на гены, селективно ингибируя и регулируя их активность. Она охарактеризовала диссоциатор и активатор как «контролирующие единицы», а позже как «контролирующие элементы», чтобы подчеркнуть их свойство влиять на работу соседних генов.[43] Она предположила, что генная регуляция может объяснить, почему в сложных многоклеточных организмах образуются различные клетки и ткани, несмотря на то, что все клетки обладают идентичным геномом. Открытие Мак-Клинток поставило под сомнение представление о геноме как о статичном наборе правил, передающихся из поколения в поколение.В 1950 году она опубликовала свою работу об активаторах и диссоциаторах.Работы Мак-Клинток по исследованию контролирующих элементов и генной регуляции в силу их сложности не сразу были осмыслены и приняты современниками. Научные изыскания воспринимались, по её словам, как «загадочные, даже враждебные».Летом 1951 года Мак-Клинток доложила об исследовании изменчивости генов на ежегодном симпозиуме в Колд Спринг Харбор. Её работа была встречена «каменным молчанием». Несмотря на это, Мак-Клинток продолжила проведение исследований контролирующих элементов. В 1953 году она опубликовала статью, где представила полученные статистические данные, и в 1950-х годах провела лекционный тур в нескольких университетах, посвящённый её работе.Она продолжила исследования в этой области и обнаружила новый элемент Супрессор-мутатор (англ. Suppressor-mutator, Spm), охарактеризованный как траспозон и обладающий сложными свойствами, так же как и комплекс Ac/Ds (система «ассоциация — диссоциация»). Основываясь на отношении научного сообщества к её работам и чувствуя опасность отчуждения от научного мэйнстрима, с 1953 года Мак-Клинток перестала публиковать отчёты об исследованиях контролирующих элементов. Исследование южноамериканских видов кукурузы. В 1957 году Мак-Клинток получила субсидии от Национального научного фонда и Фонда Рокфеллера на исследования кукурузы в Южной Америке, где велико разнообразие видов кукурузы. Она была заинтересована в изучении эволюции кукурузы, а в Южной Америке для этого у неё было бы больше возможностей. Мак-Клинток изучала хромосомные, морфологические и эволюционные признаки различных видов кукурузы. В 1962 году она возглавила группу из четырёх учёных, работавших над исследованием южноамериканских видов кукурузы в Университет Северной Каролины в Роли. Двое из них, Альмиро Блюменшайн и Энджел Като, также стипендиаты фонда Рокфеллера, продолжили исследования в этом направлении и в 1970-х годах. В 1981 году совместно с Мак-Клинток они опубликовали статью о хромосомном наборе видов кукурузы, которая считается поворотной в исследовании кукурузы и внёсшей значительный вклад в исследования эволюционной ботаники, этноботаники и палеоботаники. Повторное открытие контролирующих элементов. Мак-Клинток получила широкое признание за открытие транспозиции в конце 1960-х — начале 1970 годов после открытия этого процесса в бактериях и дрожжах. В этот период в молекулярной биологии появились новые методы, позволившие исследовать транспозицию на молекулярном уровне. В 1970-х годах Ac and Ds были клонированы, и было показано, что они относятся к транспозонам 2 типа. Ac синтезирует фермент транспозазу, необходимый для перемещения контролирующих элементов. Ds имеет мутацию в гене транспозазы, которая не позволяет ему перемещаться без стороннего источника транспозазы. Таким образом, Ds не может перемещаться в отсутствие Ac. Последующие исследования показали, что транспозоны обычно не перемещаются до тех пор, пока клетка не попадёт под воздействие радиации или не претерпит цикл «breakage-fusion-bridge», таким образом активация контролирующих элементов служит причиной генетической изменчивости. Мак-Клинток поняла эту роль транспозонов задолго до других. В наши дни комплекс Ac/Ds используется для вызывания мутаций и исследования функций различных генов.

37. Роль рекомбинационных процессов в онтогенезе. См. 38.

34. Ретровирусы и их роль в геноме. Ретровирусы - обширное семейство вирусов (Retroviridae), заражающих преимущественно позвоночных. Это РНК-содержащие вирусы, обладающие уникальным механизмом репродукции. Группа онкогенных РНК геномных вирусов. Вирионы сферической формы размером 80 - 100 нм, покрыты внешней липопротеиновой оболочкой, имеющей ворсинки длиной 8 - 10 нм. Внутри икосаэдрального капсида находится спиральный РНП. Вирусная РНК транскрибируется в ковалентно связанную двунитчатую ДНК, которая интегрируется с клеточной ДНК в виде ДНК-провируса. Провирус, экстрагированный из клетки, обладает инфекционностыо. Многие вирусы этого семейства вызывают неопластические процессы, главным образом лейкемии и саркомы ряда видов животных. Нормальные клетки некоторых видов животных содержат интегрированные копии соответствующих видов онковирусов. Они могут никак не проявляться или активируются некоторыми физическими и химическими факторами, а возможно, и при инфекции другими онковирусами. Часто встречаются дефектные вирусы, размножающиеся с помощью вируса-помощника. Передаются вертикально и горизонтально.. Ревертаза не только ведет синтез нити ДНК на РНК, но и осуществляет синтез второй комплементарной нити ДНК, а РНК-матрица распадается и удаляется. Двухнитевая ДНК синтезируется в цитоплазме, а затем перемещается в ядро и может встроиться в геном, образуя провирус. Находясь в хромосоме, провирус стабильно наследуется в ряду поколений как обычный ген. В хромосомах млекопитающих содержатся так называемые эндогенные провирусы, которые безвредны, а может быть, даже несут какие-нибудь биологические функции. Провирус ограничен так называемыми длинными концевыми повторами (ДКП), содержащими обычно по 250-700 нуклеотидных пар. Они необходимы для транскрипции провируса и его репликации (воспроизведения). Левый повтор содержит промотор, с которым взаимодействует РНК-полимераза, начинающая синтез РНК. Синтезированная молекула РНК, равно как и РНК из вирусной частицы, заразившей клетку, транслируется с образованием белков-ферментов, необходимых для синтеза ДНК провируса и его внедрения в геном, а также белков самой вирусной частицы. В некоторых случаях может образоваться зрелый вирус, содержащий РНК, упакованную в белковую оболочку. Вирусная частица может выйти из одной клетки и заразить другие. Для встраивания (интеграции) ДНК провируса необходим фермент интеграза, разрезающий ДНК-мишень и сходный по механизму своего действия с транспозазой. Наличие ДКП не только обеспечивает транскрипцию, но и полноценную репликацию провируса с двумя ДКП. Может случиться, что в процессе обратной транскрипции и репликации ДНК в состав будущего провируса случайно попадет материал других клеточных генов, если, например, ревертаза будет копировать какие-либо клеточные РНК. Ревертаза работает неточно, она может вносить ошибки в нуклеотидную последовательность ДНК, образующуюся на РНК, в отличие от ДНК-полимеразы, работающей почти безошибочно при воспроизведении всех хромосом. Если такая ошибочно скопированная последовательность, соответствующая некоторым важным генам, управляющим размножением клеток, попадет в состав провируса и, следовательно, в геном клетки, то это событие может привести к злокачественному перерождению клетки, поскольку клетка теперь будет нести ген, кодирующий измененный белок, отвечающий за рост и размножение клеток. Поэтому ретровирусы, несущие протоонкогены, опасны для клетки и организма.