obshaja_cytologija

репликации или транскрипции, а также участки ДНК, регулирующие эти процессы.

Методом гибридизации нуклеиновых кислот прямо на хромосомах (in situ) была изучена локализация этой фракции. Для этого на изолированной сателлитной ДНК с помощью бактериальных ферментов синтезировали меченую 3Н-уридином РНК. Затем цитологический препарат с хромосомами подвергали такой обработке, при которой происходит денатурация ДНК (повышенная температура, щелочная среда и др.). После этого на препарат помещали меченную 3Н РНК и добивались гибридизации между ДНК и РНК. Радиоавтографически было обнаружено, что большая часть метки локализуется в зоне первичных перетяжек хромосом, в зоне их центромерных участков. Метка обнаруживалась также и в других участках хромосом, но очень слабо (рис. 54).

За последние 10 лет сделаны большие успехи в изучении центромерных ДНК, особенно у дрожжевых клеток. Так у S. cerevisiae центромерная ДНК состоит из повторяющихся участков по 110 п.н. Она состоит из двух консервативных участков (I и III) и центрального элемента (II), обогащенного АТ-парами оснований. Сходное строение ДНК центромеры имеют хромосомы дрозофилы. Центромерная ДНК человека (альфоидная сателлитная ДНК) состоит из тандема мономеров по 170 п.н., организованных в группы димеров или пентамеров, которые в свою очередь образуют большие последовательности по 1-6 х 103 п.н. Такая самая большая единица повторена 100-1000 раз. С этой специфической центромерной ДНК комплексируются особые центромерные белки, участвующие в образовании кинетохора, структуры, обеспечивающей связь хромосом с микротрубочками веретена и в движении хромосом в анафазе (см. ниже).

ДНК с высокоповторяющимися последовательностями обнаружена также в теломерных участках хромосом многих эукариотических организмов (от дрожжей до человека). Здесь чаще всего встречаются повторы, в которые входят

111

3-4 гуаниновых нуклеотида. У человека теломеры содержат 500-3000 повторов TTAGGG. Эти участки ДНК выполняют особую роль - ограничивать хромосому с концов и предотвращать ее укорачивание в процессе многократной репликации.

Недавно было найдено, что высокоповторяющиеся последовательности ДНК интерфазных хромосом связываются специфически с белками - ламинами, подстилающими ядерную оболочку, и участвуют в заякоревании растянутых деконденсированных интерфазных хромосом, тем самым определяют порядок в локализации хромосом в объеме интерфазного ядра.

Сделано предположение, что сателлитная ДНК может участвовать в узнавании гомологичных районов хромосом при мейозе. По другим предположениям, участки с часто повторяющимися последовательностями играют роль разделителей (спейсеров) между различными функциональными единицами хромосомной ДНК, например между репликонами (см. ниже).

Как оказалось, фракция умеренно повторяющихся (от 102 до 105 раз) последовательностей принадлежит к пестрому классу участков ДНК, играющих важную роль в процессах создания аппарата белкового синтеза. В эту фракцию входят гены рибосомных ДНК, которые могут быть повторены у разных видов от 100 до 1000 раз. В эту фракцию входят многократно повторенные участки для синтеза всех тРНК. Более того, некоторые структурные гены, ответственные за синтез определенных белков, также могут быть многократно повторены, представлены многими копиями. Такими являются гены для белков хроматина - гистонов, повторяющихся до 400 раз.

Кроме того, в эту фракцию входят участки ДНК с разными последовательностями (по 100-400 нуклеотидных пар), также многократно повторенными, но рассеянными по всему геному. Их роль еще не до конца ясна. Высказывается предположение, что такие участки ДНК могут представлять собой акцепторные или регуляторные участки разных генов.

112

Итак, ДНК эукариотических клеток гетерогенна по составу, содержит несколько классов последовательностей нуклеотидов: часто повторяющиеся последовательности (> 106 раз), входящие во фракцию сателлитной ДНК и не транскрибирующиеся; фракция умеренно повторяющихся последовательностей (102-105), представляющих блоки истинных генов, а также короткие последовательности, разбросанные по всему геному; фракция уникальных последовательностей, несущая информацию для большинства белков клетки.

Исходя из этих представлений становятся понятными те различия в количестве ДНК, которые наблюдаются у разных организмов: они могут быть связаны с неодинаковой долей тех или иных классов ДНК в геноме организмов. Так, например, у амфибии Amphiuma (у которой ДНК в 20 раз больше, чем у человека) на долю повторяющихся последовательностей приходится до 80% от всей ДНК, у луков - до 70, у лосося - до 60% и т.п. Истинное же богатство генетической информации должна отображать фракция уникальных последовательностей. Не нужно забывать, что в нативной, нефрагментированной молекуле ДНК хромосомы все участки, включающие уникальные, умеренно и часто повторяющиеся последовательности, связаны в единую гигантскую ковалентную цепь ДНК.

Молекулы ДНК гетерогенны не только по участкам разной нуклеотидной последовательности, но и различны в отношении их синтетической активности.

Репликация эукариотических ДНК

Бактериальная хромосома реплицируется как одна структурная единица, имеющая одну стартовую точку репликации и одну точку терминации. Таким образом бактериальная циклическая ДНК является одним репликоном. От стартовой точки репликация идет в двух противоположных направлениях, так что по мере синтеза ДНК образуется так называемый глазок репликации, ограниченный с двух сторон репликационными вилками, что хорошо видн при электронномикроскопическом изучении вирусных и бактериальных реплицирующихся хромосом.

113

У эукариотических клеток организация репликации иного характера – полирепликоннная.. Как уже говорилось, при импульсном включении 3НТ множественная метка появляется практически во всехмитотических хромосомах. Это означает, что одновременно в интерфазной хромосоме существует множество мест репликации и множество автономных точек начала репликации. Более подробно это явление было изучено с помощью радиоавтографии меченых молекул, выделенных ДНК (рис. 55).Если клетки были импульсно мечены 3НТ, то в световом микроскопе на автографах выделенных ДНК можно видеть участки восстановленного серебра в виде пунктирных линий. Это небольшие отрезки ДНК, которые успели реплицироваться, а между ними расположены участки нереплицированной ДНК, которая не оставила радиоавтографа и поэтому остается невидимой. По мере увеличения времени контакта 3НТ с клеткой величина таких отрезков возрастает, а расстояние между ними уменьшается. Из этих экспериментв можно точно рассчитать скорость репликации ДНК у эукариотических организмов. Скорость движения репликационной вилки оказалась равной 1-3 т.п.н. в мин у млекопитающих, около 1 т.п.н. в мин у некоторых растений, что намного ниже скорости репликации ДНК у бактерий (50 т.п.н. в мин.). В этих же экспериментах была прямо доказана полирепликонная структура ДНК хромосом эукариот: по длине хромосомной ДНК, вдоль нее, располагается множество независимых участков репликации – репликонов. По расстоянию между средними точками смежных метящихся репликонов, т.е. по расстоянию между двумя соседними стартовыми точками репликации, можно узнать величину отдельных репликонов. В среднем величина репликонову высших животных составляет около 30 мкм или 100 т.п.н. Следовательно, в гаплоидном наборе млекопитающих должно быть 20 000-30 000 репликонов. У низших эукариот величина репликонов меньше, около 40 т.п.н. Так у дрозофилы на геном приходится 3500 репликонов, а у дрожжей – 400. Как говорилось, синтез ДНК в репликоне идет в двух противоположных направлениях. Это легко доказывается

114

радиоавтографически: если клеткам после импульсной метки дать продолжить синтезировать ДНК некоторое время в среде без 3НТ, то произойдет падение включения его в ДНК, будет происходить как бы разбавление метки, и на радиоавтографе можно будет видеть симметричное, с двух сторон реплицируемого участка, уменьшение количества зерен восстановленного серебра.

Реплицирующиеся концы или вилки в репликоне прекращают движение, когда встретятся с вилками соседних репликонов (в терминальной точке, общей для соседних репликонов). В этом месте реплицированные участки соседних репликонов объединяются в единые ковалентные цепи двух новосинтезированных молекул ДНК. Функциональное подразделение ДНК хромосом на репликоны совпадает со структурным подразделением ДНК на домены или петли, основания которых, как уже упоминалось, скреплены белковыми связками.

Таким образом весь синтез ДНК на отдельной хромосоме протекает за счет независимого синтеза на множестве отдельных репликонов, с последующим соединением концов соседних отрезков ДНК. Биологический смысл этого свойства становится ясным при сравнении синтеза ДНК у бактерий и эукариот. Так бактериальная монорепликонная хромосома длиной в 1600 мкм синтезируется со скоростью около получаса. Если бы сантиметровая молекула ДНК хромосомы млекопитающих реплицировалась тоже как монорепликонная структура, то на это ушло бы около недели (6 суток). Но если в такой хромосоме расположено несколько сот репликонов, то для полной ее репликации понадобится всего около часа. На самом же деле время репликации ДНК у млекопитающих составляет 6-8 часов. Это связано с тем, что не все репликоны отдельной хромосомы включаются одновременно.

В некоторых случаях наблюдается одновременное включение всех репликонов или же появление дополнительных точек начала репликации, что дает возможность закончить синтез всех хромосом за минимально короткое

115

время. Это явление происходит на ранних этапах эмбриогенеза некоторых животных. Так известно, что при дроблении яиц шпорцевых лягушек Xenopus laevis синтез ДНК занимает всего 20 минут, тогда как в культуре соматических клеток этот процесс продолжается около суток. Аналогичная картина наблюдается у дрозофилы: на ранних эмбриональных стадиях весь синтез ДНК

вядре занимает 3,5 минуты, а в клетках культуры ткани – 600 минут. При этом в клетках культуры величина репликонов оказалась почти в 5 раз больше, чем у эмбрионов.

Синтез ДНК по длине отдельной хромосомы происходит неравномерно. Было обнаружено, что в индивидуальной хромосоме активные репликоны собраны в группы, репликативные единицы, которые включают в себя 20-80 точек начала репликации. Это следовало из анализа радиоавтографов ДНК, где наблюдалась именно такая сблоченность реплицирующихся отрезков. Другим основанием для представления о существовании блоков или кластеров репликонов или репликационных единиц были эксперименты с включением в ДНК аналога тимидина - 5’-бромдезоксиуридина (BrdU). Включение BrdU в интерфазный хроматин приводит к тому, что во время митоза, участки с BrdU конденсируются

вменьшей степени (недостаточная конденсация), чем те участки, где включался тимидин. Поэтому те участки митотических хромосом в которые включился BrdU, будут слабо окрашиваться при дифференциальной окраске. Это позволяет на синхронизированных культурах клеток выяснить последовательность включения BrdU, т.е. последовательность синтеза ДНК по длине одной взятой хромосомы. Оказалось, что происходит включение предшественника в большие участки хромосомы. Включение разных участков происходит строго последовательно в течение S-периода. Каждая хромосома характеризуется высокой стабильностью порядка репликации по своей длине, имеет свой специфический рисунок репликации.

Кластеры репликонов, объединенные в репликационные единицы, связаны с белками ядерного матрикса (см. ниже), которые вместе с ферментами

116

репликации образуют т.н. кластеросомы – зоны в интерфазном ядре, в которых идет синтез ДНК.

Порядок, в котором активируются репликационные единицы, может, вероятно, определяться структурой хроматина в этих участках. Так, например, зоны конститутивного гетерохроматина (вблизи центромеры) реплицируются обычно в конце S-периода, также в конце S-периода удваивается часть факультативного гетерохроматина (например, X-хромосома самок млекопитающих). Особенно четко во времени последовательность репликации участков хромосом коррелирует с рисунком дифференциальной окраски хромосом: R-сегменты относятся к ранореплицирующимся, G-сегменты соответствуют участкам хромосом с поздней репликацией. C-сегменты (центромера) – места самой поздней репликации.

Так как в разных хромосомах величина и число разных групп дифференциально окрашенных сегментов различно, то это создает картину асинхронного начала и завершения репликации разных хромосом в целом. Во всяком случае, последовательность начала и окончания репликации отдельных хромосом в наборе не беспорядочная. Существует строгая последовательность репродукции хромосом относительно других хромосом в наборе.

Длительность процесса репликации отдельных хромосом прямо не зависит от их размеров. Так крупные хромосомы человека группы А (1-3) оказываются мечеными в течение всего S-периода, так же как и более короткие хромосомы группы В (4-5).

Таким образом, синтез ДНК в геноме эукариот начинается почти одновременно на всех хромосомах ядра в начале S-периода. Но при этом происходит последовательное и асинхронное включение разных репликонов как в разных участках хромосом, так и в разных хромосомах. Последовательность репликации того или иного участка генома строго детерминирована генетически. Это последнее утверждение доказывается не только картиной включения метки в разные отрезки S-периода, но также тем, что существует

117

чувствительности определенных генов к мутагенам.

Основные белки хроматина - гистоны

Роль ДНК в составе как интерфазных хромосом (хроматин интерфазного ядра), так и митотических хромосом достаточно ясна: хранение и реализация генетической информации. Однако для выполнения этих функций в составе интерфазных ядер необходимо иметь четкую структурную основу, которая позволила бы расположить огромные по длине молекулы ДНК в строгом порядке, чтобы с определенной временной последовательностью протекали процессы как синтеза РНК, так и редупликации ДНК В интерфазном ядре концентрация ДНК достигает 100 мг/мл (!). В среднем на интерфазное ядро млекопитающих приходится около 2 м ДНК, которая локализуется в сферическом ядре со средним диаметром около 10 мкм. Это значит, что такая огромная масса ДНК должна как-то быть уложена с коэффициентом упаковки 1 х 103--1 х 104. И при этом в ядре должен сохраниться определенный порядок в расположении частично или полностью деконденсированных хромосом. И кроме того, должны быть реализованы условия для упорядоченного функционирования хромосом. Ясно, что все эти требования не могут быть осуществлены в бесструктурной, хаотической системе.

В клеточном ядре ведущую роль в организации расположения ДНК, в ее компактизации и в регулировании функциональных нагрузок принадлежит ядерным белкам. Как уже указывалось, хроматин представляет собой сложный комплекс ДНК с белками, дезоксирибонуклеопротеин (ДНП), где на долю белков приходится около 60% от сухого веса. Белки в составе хроматина очень разнообразны, но их можно разделить на две группы: гистоны и негистоновые белки. На долю гистонов приходится до 80% от всех белков хроматина. Их взаимодействие с ДНК происходит за счет солевых или ионных связей и неспецифично в отношении состава или последовательностей нуклеотидов в молекуле ДНК. Несмотря на преобладание в общем количестве, гистоны

118

представлены небольшим разнообразием белков: эукариотические клетки содержат всего 5-7 типов молекул гистонов. В отличие от гистонов, т.н. негистоновые белки большей частью специфически взаимодействуют с определенными последовательностями молекул ДНК, очень велико разнообразие типов белков, входящих в эту группу (несколько сот), велико разнообразие функций, которые они выполняют.

Гистоны связаны с ДНК в виде молекулярного комплекса, в виде субъединиц или нуклеосом. До этого считалось, что ДНК равномерно покрыта этими белками, связь которых с ДНК определяется свойствами гистонов.

Гистоны – белки характерные только для хроматина, обладают рядом особых качеств. Это основные или щелочные белки, свойства которых определяются относительно высоким содержанием таких основных аминокислот как лизин и аргинин. Именно положительные заряды на аминогруппах лизина и аргинина обусловливают солевую или электростатическую связь этих белков с отрицательными зарядами на фосфатных группах ДНК. Эта связь достаточно лабильна, легко нарушается, в этом случае может происходить диссоциация ДНП на ДНК и гистоны. Поэтому хроматин, дезоксирибонуклеопротеин или ще как называли раньше, нуклеогистон, является сложным нуклеиново-белковым комплексом, в который входят линейные высокополимерные молекулы ДНК и огромное множество молекул гистонов (до 60 млн. копий каждого типа гистонов на ядро).

Гистоны – наиболее хорошо биохимически изученные белки (см. табл. 5). Таблица 5. Общие свойства гистонов млекопитающих

119

Гистоны – относительно небольшие по молекулярной массе белки. Эти белки практически у всех эукариот обладают сходными свойствами, обнаруживаются одни и те же классы гистонов. Классы гистонов отличаются друг от друга по содержанию разных основных аминокислот. Так гистоны H3 и H4 относят к аргинин-богатым, из-за относительно высокого содержания в них этой аминокислоты. Эти гистоны являются наиболее консервативными из всех исследованных белков: их аминокислотные последовательности практически одинаковы даже у таких отдаленных видов как корова и горох (всего две аминокислотных замены).

Два других гистона H2A и H2B относятся к умеренно обогащенным лизином белкам. У различных объектов внутри этих групп гистонов обнаруживаются межвидовые вариации в их первичной структуре, в последовательности аминокислот.

Гистон H1, представляет собой не уникальную молекулу, а класс белков, состоящих из нескольких достаточно близкородственных белков с перекрывающимися последовательностями аминокислот. У этих гистонов обнаружены значительные межвидовые и межтканевые вариации. Однако их общим свойством является обогащенность лизином, что делает их самыми основными белками, которые легко отделяются от хроматина в солевых (0,5 М) растворах. В растворах с высокой ионной силой (1-2 М NaCI) все гистоны полностью отделяются от ДНК и переходят в раствор.

Для гистонов всех классов (особенно для H1) характерно кластерное распределение основных аминокислот, лизина и аргинина, на N- и C-концах

120