obshaja_cytologija

полианионов, декстрансульфата и гепарина. В этом случае хромосомы настолько деконденсируются, что перестают быть видны в фазово-контрастном микроскопе. При добавлении же флуорохрома, связывающегося с ДНК (этидиум бромид), было видно, что сильно набухшие хромосомы не разваливались, а значительно (до 4 раз) увеличивались в длину и ширину. Такие сильно набухшие, лишенные гистонов хромосомы помещали на подложку и рассматривали в электронный микроскоп.

Оказалось, что набухшие хромосомы состоят из двух компонентов: из рыхлой сети плотных фибрилл в центральных участках (хромосомный остов – скэффолд), повторяющих контуры метафазных хромосом (осевые компоненты), и из многочисленных длинных тонких петель, отходящих от них в поперечном направлении (рис. 77). Была показана белковая природа осевых компонентов и ДНК в составе петель. Средний размер боковых петель составлял около 30 мкм. Если такие препараты обработать ДНКазой, то можно получить белковые остовы и анализировать их состав. Оказалось, что в них присутствует около 20 белков негистоновой природы, сходных с белками ядерного матрикса. Исходя из этого, была предложена модель структурной организации митотических хромосом. В ее основе лежит принцип поперечного расположения петель ДНК вдоль белковой осевой структуры. В принцип этот тип организации митотической хромосомы очень напоминает хромосомы типа «ламповых щеток», встречающихся в процессе мейоза.

Петлевое расположение ДНК вдоль хромосомы получило в дальнейшем целый ряд подтверждений. Однако при разных способах депротеинизации кроме петель в периферии набухших хромосом можно было выявить и розеткоподобные структуры, состоящие из ДНК.

В последнее время получены данные, говорящие о том, что осевые структуры могут представлять собой артефакт, получившийся в результате монтажа и высушивания дегистонизированных хромосом на подложке. На самом же деле в теле хромосомы существуют негистоновые белковые связки (скрепки),

151

сшивающие основания боковых петель ДНК, но эти связки разбросанные рыхло по объему хромосомы (рис. 78). Как бы то ни было, принцип петлевой поперечной укладки ДНК в теле хромосомы очень важен для понимания ее общей ультраструктурной организации.

Необходимо подчеркнуть, что на поперечных и продольных сечениях митотических хромосом, фиксированных в нативном состоянии внутри клеток никаких центральных или осевых элементов не обнаружено. Они выявляются только после удаления из выделенных хромосом всего набора гистонов, чему предшествует изоляция хромосом в гипотонической среде.

На основании этих наблюдений широкое распространение нашла христоматийная схема, объясняющая общую структуру митотической хромосомы (рис. 79). По этой схеме первым уровнем компактизации ДНК является нуклеосомная фибрилла, толщиной 10 нм, где вокруг одной нуклеосомы, оборачивается 146 п.н. ДНК с коэффициентом компактности равным 6-7 (к.к. 6-7); второй уровень – 30 нм фибрилла-соленоид (к.к. 40); третий уровень – петлевой домен, 60 т.п.н. на петле в 0,2-0,3 мкм (к.к. 680). Далее отрезок примерно с 18-20 петлевыми доменами образуют вокруг осевого элемента хромосомы один виток диаметром 0,7-0,8 мкм (толщина хроматиды) с коэффициентом компактизации 12 х 104. Такой виток из петлевых доменов может представлять собой минимального размера бэнд, а набор из нескольких витков – средний бэнд.

По другим представлениям можно предположить, что петле ДНК, выявляемой на хромосомах, лишенных гистонов, соответствует хромомер, промежуточным этапом деконденсации которого является розеткоподобная структура ДНП.

Важно отметить, что хромомерные участки ДНП встречаются и в интерфазных ядрах (там они называются хромоцентрами). Оказалось, что порядок их деконденсации такой же, что и в митотической хромосоме: из хромоцентров возникают розеткоподобные структуры с петлями ДНП по их периферии.

152

Итак, можно несколько иначе оценить некоторые этапы компактизации ДНК, которые приводят в конце концов к построению плотного тела митотической хромосомы (рис. 80).

Первый уровень – нуклеосомный – образует сверхскручивание ДНК по поверхности гистоновой сердцевины. Второй – нуклеомерный (сверхбусина), где идет объединение 8-10 нуклеосом в виде глобулы. Так как все эти уровни компактизации происходят на огромных линейных молекулах ДНК, то ряд сближенных нуклеомеров и образует 20-30-нанометровую фибриллу ДНП. Третий уровень – хромомерный:: петли фибрилл ДНП, объединенные скрепками из негистоновых белков, образуют компактные тела, которые при искусственной деконденсации дадут розетковидные структуры. Расположение петлевых доменов, хромомеров, может быть неравномерным; участки тела митотической хромосомы, обогащенные ими, могут соответствовать «бэндам» или сегментам при дифференциальной окраске хромосом. Четвертый уровень – хромонемный: сближенные в линейном порядке хромомеры образуют толстые (0,1-0,2 мкм) хромосомные нитчатые структуры, которые можно уже наблюдать и в световом микроскопе. Характер упаковки этой нити в теле хроматиды еще недостаточно выяснен; возможна спиральная укладка хромонемы, но не исключено образование ею и еще одного уровня петлистых структур.

Конечно, такая общая схема организации митотических хромосом очень неполно отражает особенности строения их специализированных участков таких как ядрышковый организатор, теломеры и центромеры.

Часть III

Ядерные транскрипты и их транспорт

Одна из важнейших функций клеточного ядра является реализация генетической информации в виде синтеза целого ряда РНК или служащих матрицами для синтеза белка, или образующих аппарат белкового синтеза. Синтез разного типа РНК на матрицах ДНК хроматина, транскрипция, включает в себя образование нескольких типов РНК, синтезируемых с помощью

153

различных РНК-полимераз, ферментов синтезирующих РНК по одной из цепей матричной ДНК. Всего в эукариотических клетках встречается 5 типов РНК (см. табл. 8).

Таблица 8. Типы РНК, их количество, стабильность и ферменты,

Информационные РНК, самые разнообразные по величине и по строению нуклеотидных последовательностей являются самыми нестабильными по времени их жизни: они синтезируются в большом количестве и быстро деградируют, что обеспечивает смену функциональных активностей клетки. В связи с их быстрой заменой общее число их относительно невелико, 10% от массы всех РНК в клетке. Эти иРНК синтезируются при участии фермента РНКполимеразы II, которая может образовывать первичную копию РНК с любого гена, кодирующего структуру белка. Дальнейшее созревание этих первичных транскриптов, их значительное укорочение и перестройка (сплайсинг – см. ниже) происходит с помощью особых рибонуклеопротеидных частиц, содержащих малые ядерные РНК (мяРНК). Эти мяРНК сннтезируются также с помощью этого фермента, их количество в клетке невелико (5%), но они более

154

стабильны и долгоживущие. К мяРНК относится целая гетерогенная группа РНК, входящая в состав малых РНП-частиц, таких как SRP, теломераза, сплайсосомы и др. (см. ниже). Все остальные клеточные РНК необходимы для создания аппарата белкового синтеза. Рибосомные РНК синтезируются с помощью РНК-полимеразы I, они представляют основную массу клеточных РНК и относительно стабильны. Одна из рибосомных РНК, 5S РНК, а также 20 трансферных РНК, тоже стабильных, синтезируются с помощью РНКполимеразы III. Митохондриальные РНК синтезируются в самих митохондриях независимо от синтеза РНК в ядре.

Реализация генетической информации, выражающаяся в синтезе разнообразных молекул РНК должна быть связана с изменением морфологии ядерных компонентов. На светооптическом уровне активация ядерной транскрипции всегда связана с деконденсацией хроматина, с увеличением объема ядрышек, с повышением их базофилии, т.е. с увеличением в них количества РНК. Эти общие признаки увеличения ядерной активности мало что дают для понимания хода молекулярных процессов на уровне реальных ядерных компонентов. Что происходит с участками хроматина, заключающими индивидуальный ген, кодирующий определенный белок, изучать очень трудно, т.к. эти гены в подавляющем большинстве случаев существуют в единичных копиях и проследить в гигантском клубке деконденсированных интерфазных хромосом за работой индивидуального гена чрезвычайно трудно (хотя и возможно).

Относительно более просто эту же задачу можно решить на генах многократно повторенных в геноме, таких как гены рибосомных РНК, входящих в состав интерфазных ядрышек, основной функцией которых является образование рибосом. Изучая ультраструктуру ядрышек и особенности морфологии синтеза рибосомных РНК впервые удалось с помощью электронного микроскопа визуализировать работающий ген.

155

Глава 8. Ядрышко – источник рибосом

Внутри интерфазных ядер как при витальных наблюдениях, так и на фиксированных и окрашенных препаратах видны мелкие, обычно шаровидные тельца – ядрышки. Впервые ядрышки были описаны Фонтана в 1774 г. В живых клетках они выделяются на фоне диффузной организации хроматина из-за своей светопреломляемости. Последнее свойство связано с тем, что ядрышки являются наиболее плотными структурами в клетке. Ядрышки обнаруживаются практически во всех ядрах эукариотических клеток за редким исключением. Это говорит об обязательном присутствии этого компонента в клеточном ядре.

В клеточном цикле ядрышко присутствует в течение всей интерфазы: в профазе по мере компактизации хромосом во время митоза оно постепенно исчезает, и отсутствует в мета- и анафазе, и вновь появляется в середине телофазы, чтобы сохраняться вплоть до следующего митоза, или до гибели клетки.

Долгое время функциональное значение ядрышка было непонятно. Вплоть до 50годов исследователи считали, что вещество ядрышка представляет собой своего рода запас, который используется и исчезает в момент деления ядра.

Однако еще в 30-х годах рядом исследователей (МакКлинток, Хейтц, Навашин) было показано, что возникновение ядрышек связано топографически с определенными зонами на особых, ядрышкообразующих хромосомах. Эти зоны были названы ядрышковыми организаторами, а сами ядрышки представлялись как структурное выражение хромосомной активности. Позднее в 40-х годах, когда было найдено, что ядрышки содержат РНК, стала понятна их «базофилия», сродство к основным (щелочным) красителям, из-за кислой природы РНК. По данным цитохимических и биохимических исследований основным компонентом ядрышка является белок: на его долю приходится до 7080% от сухого веса. Такое большое содержание белка и определяет высокую плотность ядрышек. Кроме белка в составе ядрышка обнаружены были нуклеиновые кислоты: РНК (5-14%) и ДНК (2-12%).

156

Уже в 50-х годах при изучении ультраструктуры ядрышек в их составе были обнаружены гранулы, сходные по своим свойствам с цитоплазматическими гранулами рибонуклеопротеидной природы, с рибосомами. Следующим этапом в изучении ядрышка было открытие принципиального факта – «ядрышковый организатор» является вместилищем генов рибосомных РНК.

Строение рибосом

Рибосома представляет собой элементарную клеточную машину синтеза любых белков клетки. Все они построены в клетке одинаково, имеют одинаковую молекулярную композицию, выполняют одинаковую функцию – синтез белка – поэтому их можно так же считать клеточными органоидами. В отличие от других органоидов цитоплазмы (пластид, митохондрий, клеточного центра, мембранной вакуолярной системы и др.) они представлены в клетке огромным числом: за клеточный цикл их образуется 1 х 107 штук. Поэтому основная масса клеточной РНК представляет собой именно рибосомную РНК. РНК рибосом относительно стабильна, рибосомы могут существовать в клетках культуры ткани в течение нескольких клеточных циклов. В печеночных клетках время полужизни рибосом составляет 50-120 часов.

Рибосомы – это сложные рибонуклеопротеидные частицы, в состав которых входит множество молекул индивидуальных (неповторенных) белков и несколько молекул РНК, Рибосомы прокариот и эукариот по своим размерам и молекулярным характеристикам отличаются, хотя и обладают общими принципами организации и функционирования. К настоящему времени методом рентгеноструктурного анализа высокого разрешения полностью расшифрована структура рибосом.

Полная, работающая рибосома, состоит из двух неравных субъединиц, которые легко обратимо диссоциируют на большую субъединицу и малую. Размер полной прокариотической рибосомы составляет 20 х 17 х 17 нм, эукариотической – 25 х 20 х 20. Полная прокариотическая рибосома имеет коэффициент седиментации 70S и диссоциирует на две субъединицы: 50S и 30S.

157

Полная эукариотическая рибосома, 80S рибосома, диссоциирует на 60S и 40S субъединицы. Форма и детальные очертания рибосом из разнообразных организмов и клеток, включая как прокариотические, так и эукариотические, поразительно похожи, хотя и отличаются рядом деталей. Малая рибосомная субъединица имеет палочковидную форму с несколькими небольшими выступами (см. рис. 81), ее длина составляет около 23 нм, а ширина – 12 нм. Большая субъединица похожа на полусферу с тремя торчащими выступами. При ассоциации в полную 70S рибосому малая субчастица ложится одним концом на один из выступов 50S частицы, а другим в ее желобок. В состав малых субъединиц входит по одной молекуле РНК, а в состав большой – несколько: у прокариот – две, а у эукариот – 3 молекулы. Характеристики молекулярной

158

Таким образом в состав эукариотической рибосомы входят четыре молекулы РНК разной длины: 28S РНК содержит 5000 нуклеотидов, 18SРНК – 2000, 5,8S РНК – 160, 5SРНК – 120.Рибосомные РНК обладают сложной вторичной и третичной структурой, образуя сложные петли и шпильки на комплементарных участках, что приводит к самоупаковке, самоорганизации этих молекул в сложное по форме тело. Так, например, сама по себе молекула 18S РНК в физиологических ионных условиях образует палочковидную частицу, определяющую форму малой субъединицы рибосом.

Под действием низких ионных сил, особенно при удалении ионов магния, плотные рибосомные субъединицы могут разворачиваться в рыхлые рибонуклеопротеидные тяжи, где можно наблюдать кластеры отдельных белков, но правильных структур, типа нуклеосом, нет, т.к. нет групп из сходных белков: в рибосоме все 80 белков разные.

Для того, чтобы образовались рибосомы необходимо наличие четырех типов рибосомных РНК в эквимолярных отношениях и наличие всех рибосомных белков. Сборка рибосом может происходить спонтанно in vitro, если последовательно добавлять к РНК белки в определенной последовательности.

Следовательно для биосинтеза рибосом необходим синтез множества специальных рибосомных белков и 4-х типов рибосомной РНК. Где эта РНК синтезируется, на каком количестве генов, где эти гены локализованы, как они организованы в составе ДНК хромосом – все эти вопросы в последние десятилетия были успешно разрешены при изучении строения и функции ядрышек.

Чем определяется число ядрышек в клетке

Как уже говорилось, все клетки имеют обязательные внутриядерные структуры – ядрышки. Это правило имеет небольшое число исключений, которые, как будет видно, только подчеркивают важность и необходимость участия ядрышка в жизненных отправлениях клетки. К таким исключениям относятся клетки дробящихся яиц, где ядрышки отсутствуют на ранних этапах

159

эмбриогенеза, или клетки, закончившие развитие и необратимо специализировавшиеся как, например, некоторые клетки крови.

В остальных случаях в клетках наблюдается 1-5 ядрышек, причем их количество не строго постоянно даже у одного и того же типа клеток. Более того

внекоторых половых клетках (растущие ооциты) число ядрышек может достигать нескольких сот, т.е. на два порядка выше, чем в соседних соматических клетках. Это - т.н. амплификация ядрышек.

Еще в 30-х годах было сделано предположение, что число ядрышек зависит от числа "ядрышковых организаторов" - особых участков, на которых в телофазе происходит новообразование ядрышек интерфазного ядра. Часто ядрышковые организаторы локализованы во вторичных перетяжках хромосом (образуют вторичные перетяжки хромосом). Так у человека ядрышковые организаторы расположены в коротких плечах 13, 14, 15, 21 и 22 хромосом (10 на диплоидный набор) (рис. 82). У млекопитающих обычно имеется несколько ядрышкообразующих хромосом на диплоидный набор: у кошки - 2; у свиньи - 2; у мыши - 4; у коровы - 8. У хладнокровных позвоночных и у птиц обычно имеется только по одной паре ядрышкообразующих хромосом.

Таким образом максимальное число ядрышек в разных клетках определяется числом ядрышковых организаторов и увеличивается согласно плоидности ядра:

вкрупных полиплоидных ядрах всегда количество ядрышек больше.

Это правило подтверждается прямыми наблюдениями над мутантными особями с разным числом ядрышковых организаторов. Так у шпорцевой лягушки в норме в диплоидной клетке есть две ядрышкообразующих хромосомы и соответственно 1-2 ядрышка. У гетерозиготной особи с одной ядрышкообразующей хромосомой - 1, у гомозиготных мутантных личинок, у которых нет ядрышковых организаторов, ядрышки не возникают и не происходит синтеза рРНК. Сходные наблюдения были получены на дрозофилах с разным числом ядрышкообразующих хромосом от 0 до 4.

160