Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Химия отрасли. Учебное пособие
.pdf
Влияние природы аминокислоты на образование высших спир-
Вариант опыта
Образование дрожжами Succharomyces Carlsbergensis
XI высших спиртов, мг/100 мл
всего
н-
пропиловый
изобутиловый
изомиловый
и оптически
активный
амиловый
Контроль (2%-ное
пивное сусло +
мальтоза 9%)
11,30
0,50
1,80
9,00
То же, с добавлением аминокислот:
α-аланина
25,60
2,40
9,53 .
13,70
α-аминомасляной
кислоты
63,50
20,00
5,15
38,40
глицина
15,30
0,98
1,90
12,32
валина
50,20
3,00
35,20
12,00
лейцина
30,70
1,50
3,40
25,80
изолейцина
40,69
1,25
5,64
33,80
тов дрожжами Succharomyces Carlsbergensis XI характеризуется данными, приведенными в таблице 1. (по И.М. Грачевой).
Таблица 1
Таким образом, имеющиеся литературные данные показывают
сложность путей биосинтеза высших спиртов. Этот процесс зависит от
большого числа факторов – физиологической особенности используемого штамма дрожжей, степени аэрации, азотистого состава, рН среды,
величины первоначального засева дрожжей, температуры брожения и
др. – вследствие чего очень сложно установить единую схему возможных биохимических превращений.
Тем не менее, наблюдения позволяют установить, что накопление в среде высших спиртов зависит от биосинтетических процессов в
клетке и определяется, с одной стороны, ростом и размножением
дрожжей, а с другой, – обменом веществ сформировавшейся, но неразмножающейся клетки.
Процесс образования высших спиртов рассматривается в ряде
работ как функция биомассы дрожжей. Полагают, что при таком подходе можно прогнозировать количество высших спиртов, возникающих при брожении, и осуществлять управление их образованием через
81
биомассу дрожжей. Это в свою очередь создает предпосылки правиль-
)(
)(3,2
)(
)(
гглицерин
бкольбутиленгли
и
якислотаянтарная
укислотауксусная
я
у
8,0
я
у
ной организации технологического процесса, поскольку высшие спирты, по мнению Эрлиха, являются важной причиной многообразных
оттенков в аромате и вкусе напитков брожения.
Вторичные продукты образуются неравномерно в процессе алкогольного брожения. Так, глицеропировиноградное брожение проходит наиболее интенсивно в начале спиртового брожения. В этот период
по глицеропировиноградному циклу расходуется 10-20% сахара, тогда
как в конце – не более 1-2%. Всего в этом цикле используется 6-7%
сахара, в том числе на образование глицерина – примерно 2,5%. В связи с тем, что в первый период довольно интенсивно проходит глицеропировиноградное брожение, выход спирта получается более низким,
чем в конце. В первый период содержание уксусного альдегида быстро
увеличивается до 100-150 мг/л. После индукционного периода наблюдается более интенсивное превращение уксусного альдегида, и вскоре
устанавливается равновесие между синтезом альдегида и его последующими превращениями.
В начале брожения уксусная кислота образуется более интенсивно. Это обстоятельство связывают с возрастом дрожжевой клетки,
считая, что молодые дрожжи больше образуют уксусной кислоты. Образование янтарной кислоты и 2,3-бутиленгликоля в первый период
брожения проходит менее энергично.
Соотношение между вторичными продуктами брожения зависит
от расы дрожжей, их ферментных систем. Существуют расы дрожжей,
образующие большее или меньшее количество уксусной, янтарной
кислот и 2,3-бутиленгликоля. Это позволило классифицировать
дрожжи на шесть групп, используя отношения
в вине после полного выбраживания виноградного сусла при рН 3,17.
Э. Пейно и Ж. Риберо-Гайон показали, что отношение
ирует в конце брожения в пределах 0,5-2,0, поэтому они выделяют
дрожжи, у которых отношение уксусной кислоты к янтарной характеризуется следующими данными:
дрожжи янтарогенные,
82
;
варь-
дрожжи равновесные,
25,18,0
я
у
25,1
я
у
г
б
я
у
07,0
г
б
07,0
г
б
;
дрожжи ацетогенные,
Отношение
торов, варьирует в пределах 0,05-0,13, т. е. значительно меньше чем
Поэтому авторы различают дрожжи:
1) гликолегенные, у которых
с отношением
В каждой из первых трех групп дрожжей – янтарогенных, равновесных и ацетогенных – имеются как гликолегенные, так и малогликолегенные.
От расы дрожжей зависит и содержание в вине этилацетата и
энантового эфира. Помимо расы дрожжей, на соотношение между вторичными продуктами брожения оказывают влияние: аэрация, величина
рН, температура брожения, исходный состав сусла.
Установлено, что при анаэробном брожении образуется
наименьшее количество янтарной кислоты. Оно возрастает при аэрации сусла. Напротив, большие количества уксусной кислоты, 2,3бутиленгликоля и ацетоина возникают в анаэробных условиях брожения; содержание их уменьшается при аэрации.
При рН выше 3,0 значительно увеличивается интенсивность
глицеропировиноградного брожения, что сопровождается уменьшением выхода этилового спирта, наибольшее количество которого образуется при рН 3,0. Содержание глицерина, уксусной и янтарной кислот
увеличивается с повышением рН. Величина прироста янтарной кислоты в этой случае меньше, чем уксусной.
В кислой среде при рН < 6 уксусной кислоты много образуется
лишь в начале брожения, в то время как в щелочной при рН 7,5 образование ее происходит примерно с одинаковой интенсивностью на всех
стадиях брожения. Повышение рН особенно при брожении в анаэробных условиях вызывает уменьшение содержания ацетоина и 2,3бутиленгликоля.
(бутиленгликоль : глицерин), по данным этих ав-
.
.
и 2) малогликолегенные
83
Температура брожения оказывает влияние на выход вторичных
продуктов брожения. При этом изменение содержания их зависит от
расы дрожжей. Так, по данным Женевуа, дрожжи, склонные к синтезу
янтарной кислоты, при пониженной температуре (7°С) вызывают значительное накопление уксусной кислоты (в 2-3 раза больше). Полагают, что это обусловлено торможением превращения (конденсации)
уксусной кислоты в янтарную в начале брожения. Брожение при температуре 20°С обеспечивает обычное накопление янтарной кислоты.
Наибольшие количества сахара расходуются по глицеропировиноградному циклу с образованием глицерина при повышенной (30-35°С) температуре брожения. Содержание янтарной кислоты при этом несколько
уменьшается, в то время как количество уксусного альдегида, ацетоина
и 2,3-бyтиленгликоля увеличивается.
Имеющиеся данные показывают также, что наименьшее количество летучих кислот накапливается при температуре 15-20°С. Как повышение, так и понижение температуры (особенно при 5 и 35°С) приводит к
увеличению содержания летучих кислот в бродящей среде. По данным
Э. Пейно, при анаэробных условиях брожения больше образуется летучих
кислот, в то время как при аэрации наблюдается увеличение этилацетата.
Не только условия брожения, но и исходный состав сусла могут
оказывать влияние на конечное содержание вторичных продуктов
брожения. Так, от начального содержания сахара зависит выход уксусной кислоты, уксусного альдегида, глицерина, 2,3-бутиленгликоля.
Чем оно выше, тем больший выход данных продуктов. Заметное влияние на состав вина оказывает содержание в сусле витаминов. Недостаток тиамина, пантотеновой кислоты, никотиновой кислоты, витамина
В6, п-аминобензойной кислоты, мио-инозита, биотина не только задер-
живает брожение, но и влияет на сопутствующие процессы. Так, отсутствие пантотеновой кислоты усиливает глицеропировиноградное брожение и вызывает образование больших количеств глицерина, уксусной кислоты и 2,3-бутиленгликоля. Отсутствие мио-инозита или биотина, напротив, уменьшает образование глицерина и янтарной кислоты, а проведение брожение без тиамина дает меньшие количества ацетоина, 2,3-бyтиленгликоля. Другие витамины заметного действия на
образование вторичных продуктов брожения не оказывают.
Исходное содержание в среде аминокислот также оказывает
влияние на баланс вторичных продуктов брожения. Так, валин, аргинин и цистеин способствуют повышению содержания уксусной кислоты, аргинин – уксусного альдегида и 2,3-бутиленгликоля, цистеин –
янтарной кислоты. При введении аммиачного азота накапливается уксусная кислота и 2,3-бутиленгликоль.
84
Важными явились исследования, проведенные С.В. Дурмишидзе,
Соединения, внесенные в сусло
до начала брожения
Радиоактивность соединений,
содержащихся в вине после оконча-
ния брожения, имп/мин в 150 мл
ацетальдегид
этанол
уксусная
кислота
2,3-бутилен- гли-
коль
глицерин
1,2С14 ацетальдегид
1,2С14 уксусная кислота
2С14 молочная кислота
2С14 глицерин
3,4С14 янтарная кислота
500
100
0
18
100
9600
250
500
362
600
900
6500
650
307
250
700
24
3
400
250
1300
4563
6000
8000
757
1,2С14 ацетальдегид
1,2С14 уксусная кислота
2С14 молочная кислота
2С14 глицерин
3,4С14 янтарная кислота
720
4350
0
0
83000
470
2350
0
0
350
0
0
0
0
2400
502
3700
0
800
0
0
0
51900
2500
0
по изучению превращения вторичных продуктов брожения с использованием радиоактивного углерода. Превращения вторичных продуктов в
процессе спиртового брожения (по С.В. Дурмишидзе) характеризуются
данными, приведенными в табл. 2. Исследования показали, что винные
дрожжи используют в процессе брожения вторичные продукты. При
этом было обнаружено, что наиболее интенсивно в биомассу дрожжей
включаются уксусная кислота, уксусный альдегид, этиловый спирт, затем молочная кислота, углекислый газ и янтарная кислота, наименее
энергично – глицерин. При этом из уксусного альдегида образуются
этиловый спирт, уксусная, янтарная, фумаровая, гликолевая кислоты,
2,3-бутиленгликоль и глицерин и совсем не образуются молочная и яблочная кислоты. Эти же продукты могут образовываться также дрожжами и из уксусной кислоты. Интересным является факт образования из
уксусной кислоты винными дрожжами этилового спирта.
Таблица 2
По мнению С.В. Дурмишидзе, такое образование происходит не
непосредственным восстановлением уксусной кислоты в спирт (как
допускал Э. Пейно), а оно осуществляется через цикл ди- и трикар-
85
боксильных кислот до образования пировиноградной кислоты из ща-
Соединения,
внесенные в сусло до
начала брожения
Радиоактивность соединений, содержащихся в вине
после окончания брожения, имп/мин в 150 мл
ацетальдегид
этанол
уксусная
кислота
2,3-
бутиленгликоль
глицерин
янтарная
кислота
КНС14О3
0
30
50
0
490
151
C14H3С14H2ОH
100
14900
900
13
600
0
велевоуксусной. Данный факт объясняет использовавшийся издавна
прием исправления вин с повышенным содержанием летучих кислот
путем их повторного сбраживания на «сладких выжимках». Было показано, что в дрожжах, культивировавшихся на среде с радиоактивным
ацетатом, обнаруживаются радиоактивные трегалоза и фосфоглицериновая кислота. Установлено, что уксусная кислота используется дрожжами также для построения аминокислот, белков и жиров.
Молочная кислота преобразуется главным образом в глицерин, а
также в уксусную кислоту и этанол. Из глицерина образуется в основном молочная, гликолевая, уксусная кислоты, а также 2,3бутиленгликоль, этанол и ацетальдегид. Янтарная кислота является
источником появления яблочной, фумаровой, уксусной кислот, а также
глицерина, этанола, 2,3-бутиленгликоля и ацетальдегида.
Весьма интересным является факт усвоения и преобразования
дрожжами при брожении этилового спирта и углекислоты. Превращения
этанола и углекислоты при спиртовом брожении показаны в табл. 3.
Таблица 3
Из данных, приведенных в таблице 3, видно, что радиоактивный
углерод бикарбоната калия включается главным образом в глицерин и
янтарную кислоту, а также в уксусную кислоту и этанол. Этиловый
спирт образует в основном уксусную кислоту и глицерин, а также ацетальдегид и 2,3-бутиленгликоль.
По данным С.В. Дурмишидзе, некоторые вторичные продукты
спиртового брожения – ацетальдегид, уксусная и янтарная кислоты, а также этиловый спирт могут частично превращаться в трегалозу дрожжей,
которая в свою очередь при спиртовом брожении подвергается эндоген-
86
ным превращениям. Кроме того, при размножении и росте дрожжей ацетальдегид, этиловый спирт, уксусная и янтарная кислоты включаются
также в аминокислоты, а впоследствии и в белки дрожжей.
Из свободных аминокислот, синтезированных в присутствии указанных вторичных продуктов, дрожжами синтезировались гистидин, лизин, аргинин, глютаминовая кислота, аланин, метионин, валян и лейцин.
Активное участие вторичных продуктов спиртового брожения в
различных реакциях взаимопревращений, синтезе трегалозы, аминокислот и белков указывает на их важную роль в обмене веществ дрожжевой клетки.
Таким образом, количественное и качественное соотношения
тех или иных вторичных продуктов брожения зависят от многих факторов. Поэтому знание условий их образования дает технологу эффективное средство научной организации и управления технологическим
процессом с целью ведения его в нужном для каждого конкретного
случая направлении. Как следует из ранее изложенного, очень важно
выбрать правильно расу дрожжей, обеспечить ей оптимальный температурный и кислородный режим брожения и, тем самым, регулировать
синтез вторичных продуктов.
11.4. Изменение составных веществ сусла в процессе брожения
Изменения в составе основных веществ сусла зависят от типа
вина и могут быть весьма значительными.
Так, в результате превращения углеводов в сухих столовых винах практически нет сахарозы, гексозы находятся в очень малых количествах, содержание пентоз может составлять 0,1-0,2%.
В винах специальных типов сахаров сусла остается больше. Из
числа полисахаридов II порядка наиболее исследованы превращения
пектиновых веществ, количество которых вследствие ферментативного
гидролиза резко снижается при брожении. Изменения азотистых веществ сусла в процессе брожения обусловлены потреблением азота
сусла дрожжами, выделением в среду азотистых веществ в процессе
жизнедеятельности дрожжей, а в дальнейшем при их автолизе, выделением в осадок части белковых веществ.
В процессе размножения дрожжи интенсивно потребляют азотистые вещества сусла (аммиачный азот, азот аминокислот). Содержание
аминного азота в этот период может уменьшиться на 40-50%. При этом
глютаминовая, аспарагиновая кислоты, валин, изолейцин, лейцин, цистеин, аргинин, триптофан, тирозин, фенилаланин и метионин используются дрожжами на 75-90%.
87
Содержание пролина при брожении уменьшается незначительно. Аналогичные данные имеются также и в отношении глицина, лизина, цистина. Потребление азотистых веществ дрожжами увеличивается
при аэрации сусла. Наблюдения показывают, что механизм использования дрожжами аминокислот может быть различным.
По данным Эрлиха, при спиртовом брожении дрожжи, дезаминируя аминокислоты, используют только отщепляющийся аммиак. Остаток
аминокислоты при этом превращается в соответствующий спирт.
Такая точка зрения давала основание полагать, что все аминокислоты, α-аминогруппы которых способны дезаминироваться с образованием аммиака, должны были бы быть равноценными в качестве
питательного субстрата для дрожжей. Однако это не так. Оказалось,
что по своей питательной ценности аминокислоты можно условно разделить на три группы:
аминокислоты, хорошо усвояемые дрожжами, - лейцин, валин,
аргинин, фенилаланин, тирозин, аспарагиновая кислота;
аминокислоты, представляющие собой менее ценный (средний)
источник азота, - аланин, оксипролин, пролин;
аминокислоты, являющиеся плохим источником азота, - триптофан, гистидин, глицин, цистеин.
Различная питательная ценность аминокислот обусловлена не
только скоростью процесса дезаминирования, но и способностью
дрожжей использовать дезаминированный остаток для синтеза других
аминокислот, отсутствующих в среде. Такая точка зрения вполне согласуется с тем фактом, что на аминокислотной среде без сахара
дрожжи не размножаются или размножаются весьма слабо.
Следовательно, без промежуточных продуктов аэробного окисления дрожжевые клетки не могут использовать для синтеза белка
аминокислоты, внесенные в среду.
Согласно Стикленду, механизм дезаминирования аминокислот
можно рассматривать как взаимодействие некоторых пар аминокислот
между собой с образованием соответствующих карбоксильных кислот.
СН3 – CHNH2 – COOH + 2CH2NH2 – COOH + 2Н2О = 3СН3СООН +
Аланин Глицин
+ 3NH3 + СО2
При этом одна аминокислота служит донором водорода, а другая – его акцептором:
1. R – CHNH2 – COOH + 2Н2О → R – COOH + NH3 + СО2 + 4Н.
2. 2R1 – CHNH2 – COOH + 4H → 2R1 – CH2 – COOH + 2NH3.
88
Донорами водорода могут быть аланин, валин, лейцин, фенилаланин, цистеин, серин, гистидин, аспарагиновая кислота и глютаминовая кислота, а акцепторами – глицин, пролин, оксипролин, орнитин
и аргинин.
Такая форма потребления азота объясняет причину ускорения
роста дрожжей, культивируемых на искусственных средах, содержащих смеси аминокислот. Например, установлено, что смесь из двух
аминокислот ускоряет рост дрожжей на 19%, из трех – на 28% и дальнейшее, хотя и более медленное, ускорение роста на 50% продолжается в смеси, содержащей до 8 компонентов.
Многие аминокислоты (аргинин, гистидин, лизин, серин, тирозин) значительно лучше ассимилируются дрожжами в смеси. Ряд других аминокислот (глютаминовая, глицин, лейцин, метионин), напротив, в смеси потребляются хуже, чем когда каждая из них является
единственным источником азота.
Установлено также, что дрожжи способны ассимилировать аминокислоты без предварительного дезаминирования их. Это происходит
тогда, когда дрожжи при размножении обеспечены смесью всех аминокислот для биосинтеза белка.
Рост клеток при этом достигает максимума. При отсутствии в
среде нескольких необходимых аминокислот часть из имеющихся
аминокислот должна быть дезаминирована, чтобы получить аммиак
для синтеза недостающих.
Имеющиеся данные показывают, что 50% ассимилируемого
дрожжами азота аминокислот клетки используют без дезаминирования, 40% после дезаминирования по схеме Эрлиха и 10% после дезаминировадия, протекающего согласно механизму реакции Стикленда.
Непосредственная ассимиляция аминокислот происходит в первый
период логарифмической фазы развития дрожжей, когда среда представляет собой полноценный субстрат. В дальнейшем при значительном уменьшении количества свободных аминокислот оставшиеся аминокислоты используются после их дезаминирования по схеме Эрлиха
или Стикленда и переаминирования по схеме Браунштейна.
Наряду с потреблением азота в процессе брожения происходит
выделение в сусло азотистых веществ, в основном аминокислот.
В первую очередь дрожжи выделяют γ-аминомасляную кислоту,
аланин, аспарагиновую и глютаминовую кислоты. Затем в среду переходят другие аминокислоты. При этом винные дрожжи всегда выделяют две аминокислоты – глютаминовую и серин.
К концу брожения в связи с повышением температуры часть
дрожжевых клеток отмирает и наступает их автолиз, который продол-
89
жается затем особенно энергично на следующей стадии развития вина
Рис. 2. – Изменение количества
общего азота сусла и дрожжей
при брожении соответственно
при температуре:
1, 4 – 10°С;
2, 5 – 15°С;
3, 6 – 25°С.
– стадии формирования. В этот период среда обогащается продуктами
автолиза, основная масса которых приходятся на долю аминокислот и
полипептидов. В результате состав аминокислот в винах по сравнению
с суслом получается более разнообразный.
Из других продуктов автолиза дрожжей, переходящих в вино,
нужно назвать ферменты, пуриновые и пиримидиновые основания.
В стадии брожения выделяется в осадок часть азотистых веществ сусла, осаждаемых образующимся спиртом. Кроме того, осаждаются накапливающиеся в нем азотсодержащие танаты.
Таким образом, в результате брожения азотистые вещества сусла претерпевают глубокие изменения, и состав их в вине будет включать как формы азота исходного материала, так и азота дрожжей.
Поскольку роль азотистых веществ очень велика в последующих
процессах, связанных с формированием, coзреванием и старением вин,
проблема регулирования количества их в виноматериале применительно к винам различных типов приобретает первостепенное значение.
В качестве таких регулирующих факторов могут быть использованы температура брожения, аэрация сусла. Установлено, (В.И. Нилов,
Г.Г. Валуйко), что наименьшее количество азотистых веществ получается в виноматериале в том случае, если брожение сусла проводилось
при температуре в интервале 15-20° (рис. 2).
90
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]