Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Химия отрасли. Учебное пособие
.pdf
содержания полифенолов и интенсивных окислительных процессов эти
вина обладают цветом настоенного чая и характерным терпким вкусом, отличающимся от вкуса вин других типов. В настоящее время
разработана более прогрессивная технология кахетинских вин, предусматривающая добавление в сусло до его брожения для интенсификации окислительных процессов предварительно ферментированных выжимок. Ферментация выжимок проводится вместе с гребнями при температуре 18-20°С в течение 4-5 ч (Г.И. Беридзе).
11.2. Второй этап стадии образования вина (брожение)
Брожение является вторым этапом стадии образования вина.
В течение многих десятков лет спиртовое брожение, осуществляемое дрожжами, было предметом глубоких исследовании, благодаря
которым в настоящее время можно считать, что основные моменты
этого процесса выяснены.
Согласно современным взглядам, первая фаза брожения углеводов заключается в образовании фосфорных эфиров гексоз. При этом
молекула глюкозы под действием фермента гексокиназы присоединяет
остаток фосфорной кислоты от аденозинтрифосфата (ATФ) с образованием аденозиндифосфата (АДФ) и глюкопиранозо-6-фосфата. Вслед
за этим фосфорный эфир глюкозы обратимо превращается во фруктофуранозо-6-фосфат под влиянием фермента глюкозофосфатизомеразы
(оксоизомеразы). Затем фруктофуранозо-6-фосфат присоединяет еще
один остаток фосфорной кислоты от новой молекулы аденозинтрифосфата, образуя фруктофуранозо-1,6-дифосфат. Эта реакция катализируется фосфофруктокиназой.
В результате этих реакций молекула сахара переходит в оксоформу, приобретает большую лабильность и становится более способной к дальнейшим ферментативным превращениям.
Симметричное расположение остатков фосфорной кислоты по
концам молекулы фруктозы облегчает ее последующий разрыв в середине.
Распад гексозодифосфата на два триозофосфата катализирует
фермент альдолаза. В результате этой обратимой реакции образуется
равновесная смесь 3-фосфоглицеринового альдегида и фосфодиоксиацетона, которые могут превращаться один в другой под действием
фермента триозофосфатизомеразы.
Дальнейшему превращению подвергается фосфоглицериновый
альдегид. Фосфодиоксиацетон по мере использования фосфоглицеринового альдегида превращается под действием изомеразы фосфотриоз
в 3-фосфоглицериновый альдегид.
71
Описанные реакции можно представить в виде следующей схемы:
72
3-фосфоглицериновый альдегид присоединяет еще один остаток
фосфорной кислоты (за счет неорганического фосфора) с образованием
1,3-дифосфоглицерицового альдегида, который, дегидрируясь под действием триозофосфатдегидрогеназы, дает 1,3-дифосфоглицериновую
кислоту. Водород в этом случае переносится на окисленную форму
кофермента НАД.
Следующий этап состоит в переносе фосфорного радикала на
молекулу АДФ и образовании 3-фосфоглицериновой кислоты и АТФ.
Процесс катализируется фосфотрансферазой. Остаток фосфорной кислоты под действием фосфоглицеромутазы перемещается затем от третьего углеродного атома ко второму с образованием 2фосфоглицериновой кислоты.
Образование 2-фосфоглицериновой кислоты из 3фосфоглицеринового альдегида может быть представлено следующей
схемой:
2-фосфоглицериновая кислота под действием фермента фосфопируватгидратазы (энолазы) образует фосфоэнолпировиноградную
кислоту, которая отдает содержащийся в ней остаток фосфорной кислоты молекуле АДФ с образованием энолпировиноградной кислоты и
АТФ. Реакция переноса остатка фосфорной кислоты катализируется
фосфотрансферазой. Энолпировиноградная кислота может превратиться в более стабильную кетоформу пировиноградной кислоты. Превращения 2-фосфоглицериновой кислоты можно представить в виде следующей схемы:
73
Описанные реакции происходят во всех случаях анаэробного
распада углеводов. Дальнейшие превращения пировиноградной кислоты приводят в зависимости от условий к образованию этилового спирта или молочной кислоты либо к полному ее окислению до СО2 и Н2О
при аэробном дыхании.
При спиртовом брожении пировиноградная кислота подвергается декарбоксилированию под действием пируватдекарбоксилазы и
распадается на СО2 и ацетальдегид.
Под влиянием алкогольдегидрогеназы водород с восстановленной
формы НАД∙Н2 переносится на ацетальдегид с образованием этилового
спирта и окисленной формы НАД. Последняя, как указывалось выше,
подвергается восстановлению при реакции окисления 1,3дифосфоглицеринового альдегида в 1,3-дифосфоглицериновую кислоту.
Активная группа кофермента НАД – пиридиновое ядро никотинамида. НАД представляет собой нуклеотид никотинамида и аденина
(дифосфопиридиннуклеотид). В сочетании с протеинами НАД составляет специфические дегидрогеназы. НАД в восстановленной форме
отдает водород в начале брожения преимущественно 3фосфоглицериновому альдегиду, превращая его в глицерин, который и
накапливается в сусле в первой фазе брожения. Впоследствии в период
главного брожения водород передается преимущественно уксусному
альдегиду, который восстанавливается в этиловый спирт. Если среда
содержит серу или сульфаты, то в описываемом процессе может произойти образование Н2S. При этом медь, содержащаяся в среде, может
выпадать в осадок в виде сернистой меди.
74
При дыхании и брожении происходит распад сахара с выделени-
СНОНСООНСННСОСООНСН
3
дрогеназаЛактатдеги
3
2
ем энергии согласно следующим упрощенным уравнениям, отражающим суммарный результат дыхания и спиртового брожения:
при дыхании – С6Н12О6 + 6О2 = 6СО2 + 6Н2О + 28229 кДж;
при брожении – С6Н12О6 = 2С2Н5ОН + 2СО2 + 117 кДж.
Однако указанный ход брожения не единственный. Если,
например, в субстрате отсутствует фермент пируватдекарбоксилаза, то
не происходит расщепления пировиноградной кислоты до уксусного
альдегида и восстановлению подвергается непосредственно сама пировиноградная кислота, превращающаяся при этом в молочную кислоту,
В этой реакции используется водород восстановленной формы
НАД∙Н2. Таким путем идет образование молочной кислоты при гликолизе в животных организмах, а также при яблочно-молочнокислом
брожении.
Еще Нейбергом было показано, что при введении в бродящую
смесь бисульфита натрии связывается ацетальдегид. Этим самым восстановленный НАД∙Н2 лишается нормального акцептора водорода. Его
место занимает 3-фосфоглицериновый альдегид, который, получая от
НАД∙Н2 водород, восстанавливается до глицеринфосфорной кислоты.
Последняя гидролизуется дрожжевой фосфотрансферазой с образованием глицерина.
В результате каждая молекула глюкозы дает по одной молекуле
глицерина, СО2 и соединение ацетальдегида с бисульфитом. Эта так
называемая вторая форма брожения Нейберга изображена на следующей схеме:
75
В щелочной среде брожение происходит по третьей форме Нейберга. Ацетальдегид в условиях высоких рН не восстанавливается нормальным путем, а подвергается дисмутации: одна молекула его окисляется в уксусную кислоту, а вторая одновременно восстанавливается в
алкоголь. В этих условиях в качестве акцептора водорода от НАД∙Н2
снова выступает 3-фосфоглицериновый альдегид, из которого образуется в дальнейшем глицерин. Следовательно, при такой форме брожения
из одной молекулы глюкозы синтезируется одна молекула глицерина и
одна молекула ацетальдегида. При этом одна часть (половина) его превращается в уксусную кислоту, другая – в этиловый спирт. Третья форма
брожения Нейберга изображена на следующей схеме:
11.3. Образование вторичных продуктов брожения
Сбраживание виноградного сусла приводит к глубоким изменениям его химического состава вследствие жизнедеятельности
дрожжей. Наряду с главными продуктами – спиртом и углекислотой –
при спиртовом брожении из сахаров образуются также и вторичные
продукты, роль которых достаточно велика в формировании аромата и
вкуса вин. К числу вторичных продуктов относятся: глицерин (г), янтарная кислота (я), уксусная кислота (у), ацетальдегид (а), 2-3бутиленгликоль (б), ацетоин (ац), лимонная кислота (л), пировиноградная кислота (п), изоамиловый спирт (и), изопропиловый спирт
(пр), эфиры. Вполне понятно, что этот перечень не является полным и
поэтому не исключено в дальнейшем его уточнение.
Проведенные исследования баланса вторичных продуктов брожения позволили установить наличие зависимости, связывающей ко-
76
личество глицерина и других вторичных продуктов брожения сахаров.
В.З. Гваладзе и Л. Женевуа (более точно) независимо друг от друга
были выведены уравнения, показывающие такую зависимость,
г = п + а + 2у + 5я+2ац + б +9л + 3и + 3пр.
Поскольку основными вторичными продуктами при брожении
являются глицерин, уксусная, янтарная, пировиноградная, лимонная
кислоты, ацетальдегид, 2-3-бутиленгликоль, ацетоин, то при определений баланса пользуются упрощенным уравнением
г = п + а + 2у + 5я+ б +2ац + 9л
Сумма вторичных продуктов (Σ) в правой части этого уравнения
составляет в среднем 80-92% oт содержания глицерина.
Механизм образования вторичных продуктов спиртового брожения еще полностью не раскрыт. Известны лишь пути синтеза основных продуктов. Образование глицерина может быть объяснено, исходя
из второй формы брожения Нейберга:
глюкоза → глицерин + уксусный альдегид + углекислота.
Как уже отмечалось, эта форма брожения, называемого «глицеропировиноградным», предусматривает сбраживание глюкозы в присутствии бисульфита натрия. В этом случае уксусный альдегид, связываемый бисульфитом, выводится из дальнейшей реакции. Его место
занимает 3-фосфоглицериновый альдегид, который, получая водород
от НАД∙Н2, восстанавливается в 1-глицерофосфат. Это соединение в
результате дефосфорилирования дрожжевой фосфатазой превращается
в глицерин. Восстановительная способность среды при этом снижается, однако накопление уксусного альдегида в ней не происходит, поскольку дрожжи в связи с токсичностью последнего преобразуют его в
другие продукты. Данный факт был подтвержден экспериментально.
При введении в бродящую среду уксусного альдегида наблюдалось
увеличение содержания в ней 2,3-бутиленгликоля, ацетоина, янтарной
и уксусной кислот и уменьшение глицерина. Иначе говоря, было показано, что уксусный альдегид является основным источником образования вторичных продуктов брожения.
Исходя из имеющихся литературных данных, образование других вторичных продуктов брожения из уксусного альдегида можно
представить следующим образом.
Окисление уксусного альдегида дрожжами вызывает образование уксусной кислоты. Появление уксусной кислоты из ацетальдегида,
испытывающего дисмутацию, сопровождается образованием этилового
77
спирта. При этом затрачивается 2 молекулы альдегида. В дальнейшем в
результате дегидрирования и конденсации уксусной кислоты появляется янтарная кислота.
Вступлению уксусной кислоты в реакцию ацетилирования, однако, предшествует ее «активирование» за счет АТФ посредством коэнзима А. Далее и происходит конденсация уксусной кислоты в форме
ацетил-КоА в янтарную кислоту. Янтарная кислота может образовываться также за счет дезаминирования глютаминовой кислоты согласно
теории Эрлиха. Однако этот путь при брожении обусловливает появление лишь около 10% янтарной кислоты.
По данным А.К. Родопуло, механизм образования лимонной
кислоты дрожжами может быть представлен так. Из уксусного альдегида образовавшийся в присутствии коэнзима А и НАД ацетил-КоА
конденсируется в янтарную кислоту, которая затем через фумаровую и
яблочную превращается в щавелевоуксусную. Последняя конденсируется с новой молекулой ацетил-КоА в лимонную кислоту.
Молочная кислота, являясь вторичным продуктом, образуется
как при аэробном, так и при анаэробном брожении.
Ее предшественником является пировиноградная кислота, восстанавливающаяся в присутствии НАД∙Н2 в молочную. Существует мнение
(Лафон), что образование молочной кислоты идет при брожении в результате гидролиза фосфоглицеринового альдегида. Установлено, что пировиноградная кислота является также предшественником ацетоина при спиртовом брожении. В результате декарбоксилирования пировиноградной
кислоты синтезируется комплекс фермент-уксусный альдегид, который
дает затем свободный уксусный альдегид и образуется ацетоин.
2,3-бутиленгликоль синтезируется в результате восстановления
ацетоина. Реакция катализируется бутиленгликоль-дегидрогеназой в
присутствии НАД∙Н2. При этом наряду с 2,3-бутиленгликолем образуются муравьиная, уксусная, молочная, янтарная кислоты, а также ацетоин, глицерин.
Высшие спирты синтезируются дрожжами в процессе брожения,
а также при аэробной их жизнедеятельности. В настоящее время идентифицировано в продуктах брожения около 50 высших спиртов, которые составляют примерно 90-95% сивушного масла. В наибольших
количествах при брожении образуются изоамиловый, изобутиловый и
н-пропиловый спирты. На их долю приходится примерно 85-93% от
общей суммы высших спиртов, образовавшихся в процессе брожения.
Пути образование высших спиртов еще не изучены полностью. Согласно теории Эрлиха, образование их связывалось с дезаминированием
аминокислот и последующим декарбоксилированием и восстановлением
78
возникающих альдегидов в спирты в процессе алкогольного брожения.
ованиепереаминир
COOHNHRCНСОСООНСН )(
23
RCOCOOHCOOHNHCHCH )(
23
RCOHRCOCOOH
лированиедекарбо кси
RCHOHCOOHROHRCOH
2
2
Однако проведенные термодинамические расчеты реакций по этой схеме
не подтвердили возможности такого процесса (И.Я. Веселов).
Анализ работ по данной проблеме показывает, что реальными в
настоящее время можно считать следующие два пути синтеза высших
спиртов дрожжевой клеткой:
первый – это реакция переаминирования аминокислот среды и
клетки с пировиноградной кислотой, возникающей при спиртовом
брожении;
второй – образование высших спиртов в процессе синтеза некоторых аминокислот живой дрожжевой клеткой.
Эти оба пути неразрывно связаны с синтетической деятельностью дрожжей, с образованием нового клеточного вещества. Идею о
первом пути образования высших спиртов выдвинул И.Я. Веселов, а
затем экспериментально ее подтвердила И.М. Грачева.
В ее исследованиях было показано, что введение пировиноградной кислоты в среду всегда вызывало почти пропорциональное увеличение количества высших спиртов. Участие в биосинтезе высших
спиртов пировиноградной кислоты и аминокислот свидетельствует о
неразрывной связи углеводного и азотистого обмена веществ клетки.
Это может быть представлено следующим образом:
1.
(из цикла спиртового брожения)
(Ассимиляция клеткой)
2.
3.
Высшая кислота Высший
(на синтез липидов) спирт
Возможность осуществления клеткой этих процессор подтверждается термодинамическими расчетами.
Гипотеза об образовании высших спиртов в процессе синтеза
аминокислот была выдвинута впервые Иошизава и Ямада. Она получает в последнее время все большее экспериментальное подтверждение.
Возможные пути синтеза высших спиртов при этом были представлены Дельвегом на основании анализа литературных данных в виде приведенной схемы (рис. 1).
79
Рис. 1. – Возможные пути синтеза высших спиртов.
Полагают, исходя из современных представлений об аллостерических ферментах, что в результате проявления обратной связи при
избытке синтезируемой аминокислоты полностью или частично будут
подавляться ферменты начальных стадий, что в свою очередь повлечет
за собой изменение обмена веществ клетки и накопление других метаболитов таких как высшие спирты.
При этом избыток любой аминокислоты, имеющей хотя бы косвенное отношение к биосинтезу аминокислот, например семейства аспарагиновой кислоты, должен вызвать изменение в накоплении основных составляющих высших спиртов, а не только того представителя,
возникновение которого можно представить по схеме Эрлиха. Такое
предположение было подтверждено И.М. Грачевой, показавшей что
введение в среду α-аланина, α-аминомасляной кислоты глицина, валина, лейцина и изолейцина интенсифицирует процессы биосинтеза всех
компонентов высших спиртов по сравнению с контролем.
80
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]