Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Репликация ДНК прокариот и вирусов. Учебное пособие.pdf
>>> События в репликативной вилке ДНК E. coli. Структура ori репликации ДНК E. coli
ликазой) не синтезирует короткий РНК-праймер 10–12 нуклеотидов, а holo-pol III
не начнет удлинение РНК/ДНК-гибрида по матрице ДНК. В это время ДНК-гираза
помогает в плавлении ori, а SSB связывается с оцДНК для предотвращения ренатурации дуплекса.
Элонгация. Как только праймирование завершается, holo-pol III загружается
на ДНК и начинает синтез. Одна из родительских цепей синтезируется непрерывно
без диссоциации фермента, лидирующая, вторая — прерывисто, с помощью фрагментов Оказаки. В последнем случае загрузка синтезирующей части реплисомы происходит после синтеза каждой РНК-затравки. РНК-праймеры фрагментов Оказаки впоследствии деградируют с помощью экзонуклеазной активности RNase Н, которая специфически катализирует гидролиз РНК в составе РНК/ДНК-гибридного дуплекса, или
с помощью «ник-трансляции», катализируемой pol I, а разрывы в дочерней цепи ДНК
сшиваются с помощью ДНК-лигазы. В случае E.coli ДНК-лигаза является NAD+-зависимым ферментом.
Рис.35. Первичная структура oriC E.coli
>>> 61
>>>
Как уже упоминалось выше, репликативная вилка E.coli содержит три активные
молекулы pol III: одна ведет синтез лидирующей цепи ДНК, а две другие кооперативно функционируют на отстающий цепи. Внутри репликативной вилки происходит динамический процесс, в результате которого активные молекулы pol III могут высвобождаться из комплекса с ДНК и меняться местами с другими молекулами во время
синтеза фрагментов Оказаки. Удивительно, что при этом часто наблюдается неполный
синтез фрагментов Оказаки. Соответственно, встает вопрос о том, обмениваются ли
разные молекулы pol III своей коровой частью при непосредственном участии одного γ-комплекса или при обмене привлекаются и дополнительные core-молекулы pol III
для заполнения недосинтезированных фрагментов Оказаки.
Терминация. Прекращение репликации ДНК в клетках E. coli осуществляется при участии специфических терминальных последовательностей, находящихся на расстоянии примерно половины генома, Ter-региона и белка Tus (terminus
utilizationsubstance). Существование этих последовательностей позволяет двум репликативным вилкам двигаться только в одном направлении, но не в противоположном. Соответственно, при достижении вилкой Ter-региона ее движение останавливается (рис. 37).
А/Т-богатый
регион
Привлечение
SSB
и
DnaG
R1 R2 R4
Участки связывания DnaA
DnaB
Посадка
геликазного
комплекса
Кооперативное
связывание
DnaA
DnaA
DnaC
Расплавление
А/Т-региона
>>> 62
Рис.36. Сборка реплисомы иформирование репликативной вилки E.coli
>>> События в репликативной вилке ДНК E. coli. Структура ori репликации ДНК E. coli
В клетках E.coli Tus-белок связывается с 10 Ter-регионами, 23 пн: TerA, TerВ,…
TerJ, и действует как контргеликаза, когда встречается с геликазой репликативной вилки. Эти сайты связывания асимметричны, так что когда комплекс Tus-Ter встречается
с репликативной вилкой, двигающейся в одном направлении, комплекс диссоциирует
и репликация продолжается. Но когда комплекс сталкивается с вилкой, двигающейся
в другом направлении, формирование специфического комплекса Tus-Ter обеспечивает
гораздо больший кинетический барьер и останавливает репликацию. Несколько сайтов
Ter в хромосоме ориентированы так, что обе противоположно движущиеся вилки репликации останавливаются в нужной области.
Рис. 37. Структура терминатора репликации E. coli
Таким образом, после полной репликации кольцевой ДНК получается два связанных кольцевых дуплекса ДНК, каждый из которых содержит одну родительскую и одну
вновь синтезированную цепочку. Этот катенан можно описать как два связанных кольца, которые не могут быть разделены сами по себе. Топоизомераза IV в E.coli «развязывает» или декатенирует два кольцевых дуплекса ДНК (см. рис. 34, а).
Регуляция процесса репликации бактериального генома осуществляется на разных стадиях. Так, например, процесс характеризуется биполярностью.Были найдены
две позиции внутри oriC для каждой из двух лидирующих цепей двунаправленной репликации. В каждой позиции находятся один или два стартовых сайта. Есть предположение, что ассиметричное связывание DnaA приводит к ассиметричной сборке реплисомы и определяет полярность разматывания и движения вилки, а также синтез
праймеров на одной из двух комплементарных цепей. Предлагается, что праймер, син-
>>> 63
>>>
тезированный в пререплисоме до начала движения первой репликативной вилки в oriC,
выступает в качестве праймера лидирующей цепи для второго комплекса. При движении репликативной вилки праймеры на отстающей цепи синтезируются в неспецифических сайтах, возможно, из-за неспособности реплисомы обнаруживать нелигированные фрагменты в определенных участках вне oriC.
Кроме того, репликация хромосом у бактерий регулируется на стадии инициации.
Активная форма инициирующего белка DnaA-ATP гидролизуется до неактивной DnaAADP с помощью фермента RIDA (RegulatoryInactivationofDnaA) и превращается обратно в активную форму DnaA-ATP с помощью фермента DARS (DnaA Reactivating
Sequence), который сам дополнительно регулируется сторонней системой. Однако основным источником активной формы DnaA-ATP является синтез новых молекул. Между тем есть и несколько других белков, которые непосредственно взаимодействуют
с последовательностью oriC и регулируют инициацию обычно путем ингибирования,
т. е. за счет конкурентных взаимодействий. В E.coli эти белки включают DiaA, SeqA,
IciA, HU и ArcA-P. У E.coli есть и другие механизмы регуляции: DDAH (datA-зависимый DnaA-гидролиз), ингибирование экспрессии гена dnaA (белком SeqA), реактивация DnaA липидной мембраной.
МЕТИЛИРОВАНИЕ ORI ДНК E.COLI
ИРЕПЛИКАТИВНЫЙ ЦИКЛ
Еще один механизм регуляции репликативного цикла E.coli осуществляется через специфическое метилирование. OriC содержит 11 палиндромных сайтов метилирования 5'-GATC-3' ферментом ДНК-аденинметилтрансферазой (Dam) по N6-положению аденина в обеих цепях ДНК (рис. 38, а) [29]. Некоторые из сайтов метилирования
перекрываются с участками связывания DnaA. В определенном месте внутри ori ДНК
обнаруживает изгиб, который наиболее ярко выражен у полностью метилированных
молекул. Соответственно, для инициации репликации необходимо метилирование обеих цепей ДНК. Репликация в области oriC приводит к появлению полуметилированных ori: дочерняя цепь ДНК остается неметилированной в области oriC около 13 мин
в отличие от других сайтов 5'-GATC-3' в геноме, которые метилируются в течение полутора минут после репликации. Полуметилированный oriC неактивен, таким образом, задержка метилирования предотвращает слишком скорую повторную инициацию
репликации.
Гемиметилированные последовательности ori в комплексе с DnaA связываются
с мембранным белком SeqA, обозначая в клетке место начала репликации (рис. 38, б).
Неметилированные или полностью метилированные последовательности не связываются с мембраной. Добавление метилазы к мембранным ori-DnaA-комплексам
приводит к высвобождению комплексов. Метилаза в конечном счете модифицирует
все участки ДНК, что приводит к высвобождению ori и DnaA из комплекса с мембраной.
>>> 64
>>> Метилирование ori ДНК E. coli и репликативный цикл
а
Репликация
Метилированная ДНК
Репликация
Гемиметилированная ДНК
Задержка
метилирования
Метилированная ДНК
б
Метилированная
ДНК
Геми-
метилированная
ДНК
Репликация
Связывание
SeqA c ДНК
Связывание
ДНК с мембраной
Задержка
связывания
DnaА/ATP
Метилированная
ДНК
Рис.38. Метилирование
дочерней цепи ДНК
прирепликации E.Coli (а).
Механизм заякоривания
хромосомы E.coli спомощью
SeqA прирепликации (б)
(адаптировано из[29])
>>>
В норме все клетки должны закончить репликацию ДНК, прежде чем они смогут
продолжить деление. Репликация E.coli занимает около 40 мин; в то же время при росте
на богатых средах клетки делятся примерно каждые 20 мин, т. е. новый раунд репликации ДНК инициируется при незаконченном предыдущем раунде. Однако сестринский
ori растет медленнее и колокализуется у 0,1–0,2 поколений [30].
>>> 66
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. LehmanI.R.,MauriceJ.Bessman,ErnestS.Simms,andArthurKornberg Enzymatic
Synthesis of Deoxyribonucleic Acid: I. Preparation of substrates and partial purication of an
enzyme from Escherichia coli // J. Biol. Chem. 1958. Vol. 233. P. 163–170.
2.MauriceJ.Bessman,I.R.Lehman,ErnestS.Simms,andArthurKornbergEnzymatic
Synthesis of Deoxyribonucleic Acid: II. General properties of the reaction // J. Biol. Chem.
1958. Vol. 233. P. 171–177.
3.Reyes-LamotheR.,Possoz C.,DanilovaO., SherrattD. J. Independent positioning
and action of Escherichia coli replisomes in live cells // Cell. 2008. Vol. 133. P. 90–102.
4.McInerneyP.,JohnsonA.,KatzF.,O'DonnellM. Characterization of a triple DNA
polymerase replisome // Mol. Cell. 2007. Vol. 27. P. 527–538.
5.Reyes-Lamothe R., Sherratt D. J., Leake M. C. Stoichiometry and architecture of
active DNA replication machinery in Escherichia coli // Science. 2010. Vol. 328. P. 498–501.
6.GeorgescuR.E.,KurthI.,O'DonnellM.E. Single-molecule studies reveal the function of a third polymerase in the replisome // Nat. Struct. Mol. Biol. 2012. Vol. 19. P. 113–116.
7.Kornberg A. Biologic Synthesis of Deoxyribonucleic Acid // Science. 1960.
Vol. 131(3412). P. 1503–1508.
8.CairnsJ. The Bacterial Chromosome and its Manner of Replication as seen by Autoradiography // J. Mol. Biol. 1963. Vol. 6. P. 208–213.
9.Okazaki R., Okazaki T., Sakabe K., Sugimoto K., Sugino A. Mechanism of DNA
chain growth. I. Possible discontinuity and unusual secondary structure of newly synthesized
chains // PNAS. 1968. Vol. 59(2). P. 598–605.
10.SugimotoK.,OkazakiT.,OkazakiR.Mechanism of DNA chain growth, II. Accumu-
lation of newly synthesized short chains in E. coli infected with ligase-defective T4 phages //
PNAS. 1968. Vol. 60(4). P. 1356–1362.
11.OkazakiR.,SugimotoK.,OkazakiT.,ImaeY.,SuginoA. DNA chain growth: invivo
and in vitro synthesis in a DNA polymerase-negative mutant of E. coli // Nature. 1970.
Vol. 228(5268). P. 223–226.
12.KornbergA. Active Center of DNA Polymerase // Science. 1969. Vol. 163(3874).
P. 1410–1418.
13.MorganA. Model for DNA replication by Kornberg’s DNA polymerase // Nature.
1970. Vol. 227. P. 1310–1313.
14.OkazakiT. Days weaving the lagging strand synthesis of DNA — A personal recol-
lection of the discovery of Okazaki fragments and studies on discontinuous replication mechanism. // Proc. Jpn. Acad. Ser. B Phys. Biol. Sci. 2017. Vol. 93(5). P. 322–338.
15.VermaI.M.,MeuthN.L.,BromfeldE.,ManlyK.F.,BaltimoreD. Covalently linked
RNA-DNA molecule as initial product of RNA tumour virus DNA polymerase // Nat. New
Biol. 1971. Vol. 233(39). P. 131–134.
>>> 67
>>>
16.BrutlagD.,SchekmanR.,KornbergA. A possible role for RNA polymerase in the
initiation of M13 DNA synthesis // PNAS. 1971. Vol. 68(11). P. 2826–2829.
17.Bouché J. P., Zechel K., Kornberg A. DnaG gene product, a rifampicin-resistant
RNA polymerase, initiates the conversion of a single-stranded coliphage DNA to its duplex
replicative form // J. Biol. Chem. 1975. Vol. 250(15). P. 5995–6001.
18.PastranaC.L.,CarrascoC.,AkhtarP.,LeubaS.H.,KhanS.A.,Moreno-HerreroF.
Force and twist dependence of RepC nicking activity on torsionally-constrained DNA molecules // Nucleic Acids Res. 2016. Vol. 44(18). P. 8885–8896.
19.HoebenR.C.,UilT.G. Adenovirus DNA replication // Cold Spring Harb. Perspect.
Biol. 2013. Vol. 5(3): a013003.
20.KulczykA. W., RichardsonC. C. The Replication System of Bacteriophage T7 //
Enzymes. 2016. Vol. 39. P. 89–136.
21.JoseD.,WeitzelS. E.,BaaseW.A.,vonHippel P.H. Mapping the interactions of
the single-stranded DNA binding protein of bacteriophage T4 (gp32) with DNA lattices at
single nucleotide resolution: gp32 monomer binding // Nucleic Acids Res. 2015. Vol. 43(19).
P. 9276–9290.
22.Matsumoto T., Morimoto Y., Shibata N., Kinebuchi T., Shimamoto N., TsukiharaT.,YasuokaN. Roles of functional loops and the C-terminal segment of a single-stranded
DNA binding protein elucidated by X-Ray structure analysis // J. Biochem. 2000. Vol. 127.
P. 329–335.
23.RaghunathanS.,KozlovA.G.,Lohman T.M.,WaksmanG. Structure of the DNA
binding domain of E.coli SSB bound to ssDNA // Nat. Struct. Biol. 2000. Vol. 7(8). P. 648–652.
24.Nitiss J. L. DNA topoisomerase II and its growing repertoire of biological functions // Nat. Rev. Cancer. 2009. Vol. 9(5). P. 327–337.
25.TutejaN.,TutejaR. Prokaryotic and Eukaryotic DNA Helicases. Essential Molecular
Motor Proteins for Cellular Machinery // Eur. J. Biochem. 2004. Vol. 271(10). P. 1835–1848.
26.TrakselisM.A. Structural Mechanisms of Hexameric Helicase Loading, Assembly,
and Unwinding // F1000Res. 2016. Vol. 5. pii: F1000 Faculty Rev-111.
27.Abdel-MonemM.,DürwaldH.,Hoffmann-BerlingH. Enzymic unwinding of DNA.
2. Chain separation by an ATP-dependent DNA unwinding enzyme // Eur. J. Biochem. 1976.
Vol. 65(2). P. 441–449.
28.WangJ.C. Interaction between DNA and an Escherichia coli protein ω // J. Mol.
Biol. 1971. Vol. 55. P. 523–533.
29.AlouiA.,MayA.E.,SahbaniS.K.,LandoulsiA. Roles of Methylation and Sequestration in the Mechanisms of DNA Replication in some Members of the Enterobacteriaceae
Family // Chapter 12 in Biochemistry, Genetics and Molecular Biology “The Mechanisms of
DNA Replication”, book edited by David Stuart, ISBN 978-953-51-0991-4, Published: February 20, 2013 under CC BY 3.0 license.
30.FossumS.,CrookeE.,SkarstadK. Organization of sister origins and replisomes dur-
ing multifork DNA replication in Escherichia coli // EMBO J. 2007. Vol. 26(21). P. 4514–4522.
>>> 68
СОДЕРЖАНИЕ
Принципы репликации ................................................................................................3
Доказательства полуконсервативного механизма
репликации ДНК и хромосом .....................................................................................6
Ферментативная система синтеза ДНК invitro. Активирование ДНК ..................10
Метод ближайших соседей в доказательстве
комплементарности и антипараллельности репликации .......................................13
Строение и каталитические активности ДНК-полимеразы I E.coli .....................15
Сравнительные характеристики ДНК-полимеразы I,
ДНК-полимеразы II и ДНК-полимеразы III E.coli.
Различные формы ДНК-полимеразы III E.coli ....................................................... 16
Схемы репликации invivo Корнберга, Кэрнса и Оказаки.
Доказательства схемы прерывистой репликации Оказаки. ДНК-лигазы .............20
Жизненный цикл фага М13. Репликация фаговой ДНК.
Модель катящегося колеса ........................................................................................27
Праймирование репликации ДНК фагов G4 и ФX174.
Праймаза и праймосома ............................................................................................. 33
Репликация ДНК аденовируса ..................................................................................36
Модель «заячьи уши» ................................................................................................41
Репликация ДНК фага Т7. «Концевая избыточность» ............................................43
Белок 32 гена фага Т4. Его свойства и функции. Другие SSB их функции ..........51
SSB E.coli ...................................................................................................................53
Геликазы. Их роль в репликации ..............................................................................54
Топоизомеразы. Механизм действия релаксаз и гираз.
Модель инверсии знака .............................................................................................. 55
События в репликативной вилке ДНК E.coli.
Структура ori репликации ДНК E.coli. Роль белка DnaA ......................................60
Метилирование ori ДНК E.coliи репликативный цикл .........................................64
Список литературы ....................................................................................................66
Учебное издание
Белоусова Екатерина Анатольевна,
Дымшиц Григорий Моисеевич
РЕПЛИКАЦИЯ ДНК ПРОКАРИОТ ИВИРУСОВ
Учебное пособие
РедакторД.И.Ковалёва
Оригинал-макет А.С.Терёшкиной
Обложка Е.В.Неклюдовой
Подписано в печать 05.04.2021 г.
Формат 60 × 84 1/8. Уч.-изд. л. 8,75. Усл. печ. л. 8,1.
Заказ № 44.
Издательско-полиграфический центр НГУ
630090, Новосибирск, ул. Пирогова, 2.