Репликация ДНК прокариот и вирусов. Учебное пособие

Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

Репликация ДНК прокариот и вирусов. Учебное пособие.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

08.09.2026

Размер:

2 Мб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 1 23 / 73 4 5 6 7 > Следующая >>>

>>> Схемы репликации in vivo Корнберга, Кэрнса и Оказаки. Прерывистая репликация Оказаки

денатурацию матричной ДНК по мере продвижения и синтеза дочерних цепей в направлении 5'→3'. На выходе получаются две дочерние молекулы, которые оказываются короче на длину загнутого конца. В конце специфическая эндонуклеаза вносит разрыв в материнские цепи по оси палиндрома. Минусы этой модели очевидны. Во-первых, дочерняя цепь получается короче материнской, следовательно, с каждым раундом репликации определенная часть генетической информации просто теряется. Во-вторых, открытым остается вопрос о синхронном начале репликации двух цепей. Синхронизация нужна в том числе для того, чтобы одна из цепей материнской ДНК не оставалась в одноцепочечном состоянии.

5'5'

3'3'

Рис.12. Схема непрерывной антипараллельной репликации in vivo поКорнбергу.

3'-ОН

5'-P

3'-ОН

Зелеными стрелками обозначены места действия эндонуклеазы

5'-P

3'-ОН

5'-P5'

3'-ОН

5' 5'

3'3'

В 1963 г. Джон Кэрнс проводил свои эксперименты с E.coli. и предложил схему непрерывной параллельной репликации invivo. При выращивании бактерий Кэрнс использовал тимидин, содержащий тяжелый радиоактивный изотоп водорода 3H. Теоретически каждая вновь синтезированная дочерняя молекула должна содержать одну «горячую» цепь и одну «холодную». После различных интервалов и разного количества циклов репликации в «горячей» среде Кэрнс выделял хромосому E.coli, помещал ее на стекло, слайды покрывал фотографической эмульсией или пленкой и экспонировал этот сэндвич, а затем изучал под световым микроскопом. Кэрнс обнаружил, что после одного раунда репликации на авторадиограмме появлялись точки, расположенные по кругу (рис. 13, а). Он интерпретировал эти кольца как полуконсервативную репликацию кольцевой молекулы. Радиоавтографы, сделанные во время второго цикла ре-

>>> 21

>>>

пликации, действительно напоминали репликативные вилки, согласно предложенной модели. Исходя из распределения плотности радиоактивных зерен в трех сегментах, Кэрнс предложил интерпретацию процесса репликации, представленную на рис. 13, б. На радиоавтографах он обнаружил структуры, по форме напоминающие месяц и соответствующие прогрессивному движению репликативной вилки по кольцу ДНК. Сегодня структуры подобного вида называются тета-структурами из-за внешнего сходства с буквой греческого алфавита θ. Таким образом и родилась модель непрерывной параллельной репликации ДНК [8]. Однако она предполагала существование фермента, способного катализировать синтез ДНК в направлении 3'→5'. Такой фермент не найден и сегодня. Несмотря на то что предложенная схема оказалась неверной, она побудила к поискам новых ДНК-полимераз Е.coli.

ба

Рис.13. Схема непрерывной параллельной репликации in vivo

поКэрнсу, две стадии: экспериментальные данные (а, в)

иих интерпретация (б, г) [8]. Прямоугольники наб иг обозначают

место разрыва, соответствующее позициям X наа ив

>>> 22

>>> Схемы репликации in vivo Корнберга, Кэрнса и Оказаки. Прерывистая репликация Оказаки

В 1966–68 гг. один из бывших сотрудников Корнберга Рейджи Оказаки (1930–1975 гг.) вместе с Тцунеко Оказаки (1933 г.) и Кивако Сакабе разрешил один из ключевых вопросов о том, как именно идет репликация, начиная с того момента, как родительские цепи ДНК расходятся: синтез по двум нитям идет в противоположных направлениях, один из свободных концов, известный как 5'-конец, имеет свободную фосфатную группу, а другой — 3'-ОН группу. ДНК-полимераза может катализировать синтез ДНК непрерывно по матричной цепи только с 5'-конца. Оказаки обнаружил многократно получаемые на 3'-конце короткие фрагменты цепи ДНК, которые впоследствии соединяются между собой с помощью активности ДНК-лигазы [9, 10].

К тому моменту фундаментальным считалось знание о том, что обе цепи ДНК воспроизводятся непрерывно: одна цепь реплицируется в 5'→3'-направлении, другая — в обратном. Тем не менее все известные к тому моменту ДНК-полимеразы работали только в направлении 5'→3'. Исходя из этого, Оказаки предположил, что если репликацию рассматривать как прерывистый процесс, то короткие фрагменты ДНК должны синтезироваться вблизи репликативной вилки и впоследствии присоединяться в направлении 5'→3' к синтезированной ранее части цепи. Чтобы экспериментально «увидеть» механизм репликации ДНК, т. е. формирование коротких ДНК-фрагментов, как того требует модель, команда разработала метод импульсного мечения вновь реплицированных областей хромосомы E.coli. Для этого бактерии, инфицированные или не инфицированные фагом Т4, выращивали на обычной среде, но в определенный момент времени добавляли [3H]-тимидин на несколько секунд, чтобы метка успевала включиться лишь в ту часть ДНК, которая непосредственно приближена к репликативной вилке. Затем поводили исчерпывающую экстракцию ДНК из клеток и анализировали размер вновь синтезированных фрагментов при ультрацентрифугировании в щелочном градиенте сахарозы, при котором, во-первых, происходит денатурация цепей ДНК и, во-вторых, возможно разделение коротких и длинных молекул ДНК между собой. Некоторые из определяемых в первые короткие промежутки времени радиоактивных фрагментов оказалась короткими одноцепочечными ДНК (рис. 14, а). Ультрацентрифугирование ДНК после более длинных промежутков времени репликации выявило наличие преимущественно более длинных фрагментов ДНК (рис. 14, б). Авторы предположили, что в определенный момент времени короткие фрагменты объединяются в одну цепь с помощью активности недавно обнаруженной ДНК-лигазы. Следовательно, нужно было доказать вовлеченность лигазы в процесс репарации. Для этого авторы использовали штамм E.coli, зараженный мутантным Т4-фагом с термочувствительной формой ДНК-лигазы, неактивной при нормальной температуре роста бактериальных клеток 37 °С. При проведении эксперимента при нормальных температурах авторы обнаружили большое количество радиоактивно меченных коротких ДНК-фрагментов. При проведении эксперимента при более низких температурах, а именно при 20 °С, бóльшая часть метки конденсировалась в длинных ДНК-фрагментах. Затем был проведен один контрольный эксперимент, в котором штамм E. coli выращивали сначала при нормальных температурах, а затем переводили на более низкие. При этом количество коротких меченых ДНК-фрагментов существенно снижалось, в то время как количество длинной меченой ДНК увеличивалось. Второй контрольный эксперимент

>>> 23

>>>

60 с

, cpm/0,1 ml*10

*10

, cpm/0,1 ml

30 с

10 с

5 с

10 2 3 4

Расстояние от дна пробирки

150 с

60 с

600 с

>>> 24

1 2 3 4 5

Расстояние от дна пробирки

Рис.14. Схема антипараллельной репликации in vivo поОказаки:

распределение фрагментов ДНК вщелочном градиенте сахарозы

после импульсного мечения вкороткие (а) идлинные (б) промежутки времени (адаптировано из[9, 10]). Слева наа иб представлены результаты эксперимента, справа — схема, отображающая интерпретацию результатов;

в— конечная схема репликации

>>> Схемы репликации in vivo Корнберга, Кэрнса и Оказаки. Прерывистая репликация Оказаки

проводили, выращивая бактерий при низкой температуре с последующей инкубацией при нормальной температуре, чтобы показать, что температура и процедура экстракции ДНК сами по себе не приводят к накоплению коротких радиоактивно меченых фрагментов ДНК. Полученные группой Оказаки данные фактически выводили к предположению, что обе цепи синтезируются прерывисто в форме короткоживущих фрагментов длиной 1000–2000 нуклеотидов. И только после того как были использованы штаммы, мутантные по ферменту, ответственному за вырезание урацила, стало понятно, что фрагменты цепи ДНК, отпрепарированной этим ферментом, не имеют никакого отношения к процессу репликации и что прерывисто синтезируется только одна цепь [11].

Так стало очевидно, что при репликации две цепи ДНК синтезируются по разным механизмам (см. рис. 14). Фрагменты, которые синтезируются при репликации отстающей цепи, названы фрагментами Оказаки в его честь. Рейджи Оказаки был номинирован на Нобелевскую премию в 1975 г. и, несомненно, получил бы ее, если бы был жив к тому моменту.

На сегодняшний день прерывистость репликации показана для всех объектов, кроме фагов, содержащих одноцепочечную ДНК. Репликация генетического материала некоторых фагов и вирусов идет прерывисто по обеим цепям. При репликации ДНК бактерий и высших организмов одна цепь образуется непрерывно и называется лидирующей, а вторая — прерывисто и называется отстающей.

Помимо рассмотренных моделей репликации ДНК, в 60–70 гг. прошлого столетия были предложены и другие варианты механизмов удвоения генетического материала. Так, например, после объявления Нобелевской премии А. Корнберг и его группа сосредоточились на поиске генетически активной ДНК в различных бактериях и предложили специфическую модель репликации двойной спирали ДНК in vivo [12]. Она предполагала сочетание ДНК-полимеразы, эндонуклеазы и лигазы для обеспечения последовательной и почти одновременной репликации обеих цепей (рис. 15). Алгоритм репликации следующий. Бактериальный геном представлен двуцепочечной кольцевой ДНК, и, когда хромосома интактна, она инертна в отношении начала репликации. Ве-

а вб г д е

и расщепление

Формирование

оц-разрыва

Эндонуклеазное

расщепление

Синтез

Формирование

вилки

Рис.15. Специфическая модель репликации

двойной спирали ДНК in vivo поКорнбергу (адаптировано из[12])

ЛигированиеСинтез

>>> 25

>>>

дение одноцепочечного разрыва, т. е. ника, в конкретный сайт запускает репликацию. ДНК-полимераза связывается с местом разрыва, и репликация стартует с ковалентного присоединения dNMP к 3'-ОН концу (рис. 15, а и б). 5'-конец может быть в некоторой степени гидролизован с помощью 5'-3'-нуклеазной активности ДНК-полимеразы или вытеснен из ДНК-дуплекса. Фиксация на некотором участке клеточной мембраны может способствовать процессу вытеснения и сохранению целостности 5'-цепи. ДНК-полимераза катализирует синтез ДНК на несколько звеньев, после чего начинает использовать вытесненную 5'-цепь в качестве матричной; таким образом, формируется вилка, которая впоследствии расщепляется эндонуклеазой (рис. 15, в и г). Подобным образом происходит синтез протяженного участка ДНК, что приводит к формированию одной целой цепи, в то время как вторая цепь синтезируется в виде кусочков (рис. 15, д). Такие куски были выделены Оказаки и сотрудниками непосредственно вблизи репликативной вилки. Эти фрагменты сшиваются между собой с помощью ДНК-лигазы (рис. 15, е).

Если бы эта схема была правильной, она бы объясняла, как один фермент, ДНК-полимераза, реплицирующий ДНК исключительно в направлении 5'→3', копирует почти одновременно обе материнские цепи, обладающие противоположной полярностью. Изучение механизмов деления бактериальных клеток на стадии клеточного роста с помощью авторадиографии или путем дублирования генов показало, что существует одновременная последовательная репликация обеих нитей. Однако, как предполагает предложенная модель, на уровне нуклеотидов репликация идет в шахматном порядке, синтез одной и второй цепи ДНК идет поочередно.

P P

+2 PPi

Рис.16. Альтернативный механизм непрерывной антипараллельной

синхронной репликации поМоргану: а— формирование фосфодиэфирной связи

между двумя дочерними цепями ДНК; б — механизм встраивания dNMP

врастущую цепь ДНК (адаптировано из[13])

>>> 26

>>> Жизненный цикл фага М13. Репликация фаговой ДНК. Модель катящегося колеса

Еще один альтернативный механизм, который можно было бы назвать непрерывной антипараллельной синхронной репликацией, в 1970 г. был опубликован Морганом в журнале Nature (рис. 16) [13]. Он предполагает одновременное наращивание обеих цепей молекулы ДНК в направлении 5'→3', но цепи ДНК при этом оказываются ковалентно связанными. В конце синтеза полной цепи ДНК расщепление катализирует ДНК-полимераза. Это предположение было основано на способности ДНК-полимеразы принимать участие в процессе репарации ДНК. Несмотря на публикацию в уважаемом и высокорейтинговом журнале, со временем эта модель была отвергнута в пользу модели антипараллельной прерывистой репликации.

ЖИЗНЕННЫЙ ЦИКЛ ФАГА М13. РЕПЛИКАЦИЯ ФАГОВОЙ ДНК. МОДЕЛЬ КАТЯЩЕГОСЯ КОЛЕСА

К одному из наиболее изученных систем относится жизненный цикл фага М13 (фаг,

φαγεῖν (phagein), греч. — пожирать). Фаг M13 — это вирус, который заражает клетки E.coli, единственный фаг, не вызывающий гибели при выходе из клетки. Его геном пред-

ставлен кольцевой одноцепочечной ДНК ~ 6400 нт, заключенной в тонкую гибкую трубку, состоящую из ~ 2700 копий основного белка оболочки PVIII (50 ак), длина частицы ~ 900 нм, концы трубки закрыты другими белками (рис. 17, а). Размер фаговой частицы может варьировать в зависимости от размера ДНК, например, при уменьшении генома до 221 нуклеотидов количество РVIII уменьшается до 100 копий. Инфекция начинается, когда слой белка PIII, состоящий из 5 копий, присоединяется к рецептору на кончике F-пили бактериальной клетки. Делеция РIII приводит к потере инфекционности, как и увеличение размера фагового генома в 10–20 раз. Инфекция M13 не смертельна, однако приводит к появлению мутных бляшек на среде с E. coli, потому что инфицированные бактерии растут медленнее, чем окружающие их неинфицированные. Фаг М13 вызывает у бактерий хроническую форму инфекции, которая не является ни литической, ни умеренной. Плазмиды на основе ДНК M13 используются для наработки рекомбинантных белков, в технологии фагового дисплея, вирус также можно использовать как нанотрубку для нанотехнологических приложений. Поскольку фаг M13 может менять размеры своих частиц, а также представленность экспонированных наружу белков в зависимости от размеров и состава своего генома, он является популярным инструментом для создания и использования в качестве основы для наноструктур. Например, фаговую частицу можно сконструировать таким образом, что она будет иметь разные белки на концах и вдоль частицы. Из подобных структур можно собирать, например, с применением оксида золота или кобальта нанопроволоки для батарей или использовать их для упаковки углеродных нанотрубок в прямые пучки, необходимые в фотогальванике.

Репликация фага М13 в клетке хозяина происходит на поздних стадиях инфекционного процесса и состоит из трех разных по механизму этапов: синтеза репликативной двуцепочечной формы ДНК — репликации I, собственно размножения этой формы

>>> 27

>>>

для увеличения ее содержания в клетке — репликации II, финального ассиметричного синтеза больших количеств (+)-цепи и ее упаковки в вирусную оболочку (рис. 17, б).

В 1974 г. Р. Оказаки показал вовлеченность ферментов клетки-хозяина в процесс репликации вирусной ДНК на примере фага М13. Для этого он использовал действие рифампицина и хлорамфеникола на клетку. Рифампицин является ингибитором бактериальной РНК-полимеразы на стадии инициации транскрипции, а хлорамфеникол ингибирует процесс трансляции на бактериальных рибосомах. Оказаки показал, что если при заражении клеток E.coli фагом М13 добавить хлорамфеникол, то блокируются процессы трансляции, репликации II и стадия сборки фагов. А если обработать клетки зараженных бактерий рифампицином, то блокируется не только транскрипция и все следующие процессы, но и репликация I. Из этих данных Оказаки сделал вывод о том, что бактериальная РНК-полимераза принимает участие и в репликации фаговой ДНК.

Вот как эти исследования описывает в своих воспоминаниях Тцунеко Оказаки: «К 1971 г. уже было известно, что в инициации синтеза ДНК ретровирусов и бактериофага M13 задействована РНК [15, 16]. Эти открытия побудили нас предположить, что события, инициирующие синтез фрагмента Оказаки, также могут включать РНК. Уже было известно, что все РНК-полимеразы могут инициировать синтез полинуклеотидной цепи, не требуя затравки. Более того, ДНК-полимераза может использовать

а б

оц ДНК

pIII

pVI

pVIII

pVII

pIX

Репликация I

Репликация II

Хлорамфеникол

Трансляция

Рифмапицин

>>> 28

Рис.17. Бактериофаг М13: а— схема строения; б — основные этапы жизненного цикла

>>> Жизненный цикл фага М13. Репликация фаговой ДНК. Модель катящегося колеса

РНК-цепь в качестве праймера в том случае, если РНК образует гетеродуплексную структуру с комплементарной цепью ДНК. Однако рифампицин, ингибитор бактериальной РНК-полимеразы, который специфически связывается с β-субъединицей фермента, не ингибировал удлинение цепи геномной ДНК E. coli. Поэтому для подтверждения нашей гипотезы требовалась новая РНК-полимераза, устойчивая к действию рифампицина. По сути, фермент праймаза, который синтезирует очень короткие цепи РНК по оцДНК-матрице, был обнаружен позже, и это действительно был новый тип РНК-полимеразы, резистентной к рифампицину [17]» [14].

Подробный жизненный цикл фага М13 включает следующие стадии:

– проникновение (+)-цепи вирусной ДНК в цитоплазму бактериальной клетки;

– синтез (–)-цепи бактериальной ферментативной системой, т. е. получение двуцепочечной формы ДНК;

– образование отрицательно суперскрученной двуцепочечной ДНК с помощью топоизомеразы типа II — ДНК-гиразы с образованием родительской двуцепочечной репликативной формы (RF) ДНК;

– внесение в (+)-цепь RF ДНК одноцепочечного разрыва фаговым белком pII;

– старт репликации с 3'-гидроксильной группы ника с образованием новой вирусной дцДНК; при этом pII вытесняет вирусную (+)-цепь ДНК по кругу, делая несколько оборотов и формируя пул RF дцДНК;

– транскрипцию с (–)-цепи ДНК вируса;

– синтез разных фаговых белков по вирусной мРНК (в цитоплазме фаг представлен белками pII, pX и pV, они принимают участие в процессе репликации ДНК; другие фаговые белки синтезируются denovo и входят в состав оболочки);

– связывание вновь синтезированной одноцепочечной ДНК pV-димерами для предотвращения ее превращение в RF ДНК;

– синтез RF ДНК продолжается до момента достижения критической концентрации pV;

– переключение репликации ДНК на синтез (+)-цепи вирусной оцДНК, которая продолжается до истощения пула pV;

– начало сборки фаговой частицы с pV-ДНК-комплекса (pV-ДНК структуры достигают длины ~ 800 нм и диаметра ~ 8 нм).

В общем случае репликация плазмид осуществляется по одному из 4 механизмов: 1) образованию тета-структур, при котором синтез лидирующей и отстающей цепей инициируется близко друг от друга и обе материнские цепи остаются ковалентно связанными, а элонгация может идти в одном или двух направлениях; 2) механизму с вытеснением одной цепи, при котором синтез лидирующей цепи инициируется в одном из двух ori, расположенных на разных цепях; 3) праймированию с помощью бел- ка, который ковалентно связан с 5'-концом линейной молекулы вируса; в этом случае реализуется непрерывный синтез ДНК; 4) модели катящегося колеса, при которой Rep-белок инициирует разрыв в специфическом сайте одной из цепей, являющимся местом начала репликации (рис. 18). Фаг М13 размножается как раз посредством реализации последнего механизма. В этом случае репликация идет однонаправленно. Терминация синтеза лидирующей цепи происходит за счет Rep-зависимого фор-

>>> 29

ori

Рис.18. Механизмы репликации плазмидной ДНК:

а— образование тета-структур; б — механизм

свытеснением одной цепи; в— использование

белковой компоненты вкачестве праймера;

г — модель катящегося колеса

>>>

мирования дцДНК-продукта и оцДНК-молекулы. ОцДНК используется как матрица для синтеза отстающей цепи. Такой механизм характерен для репликации фагов с низким GC-составом. К основной особенности этого механизма можно отнести разобщенность синтеза лидирующей и отстающей цепей. Лидирующая цепь синтезируется с помощью Rep-белка, включающего в себя инициаторный белок и кодируемую плазмидой или бактериофагом нуклеазу, и участников репликации клетки-хозяина: pol III, SSB (single-stranded binding protein), т. е. белка, связывающего оцДНК, и ДНК-геликазы. Отстающая цепь синтезируется в основном с помощью репликативной машины клетки-хозяина.

Репликация некоторых кольцевых оцДНК или дцДНКмолекул, таких как плазмиды и некоторые вирусы (например, HHV6, М13), осуществляется в несколько стадий:

– внесение оц-разрыва в ДНК-дуплекс;

– удлинение 3'-конца с использованием целой цепи ДНК в качестве матрицы по принципу синтеза лидирующей цепи, 5'-конец при этом вытесняется;

– формирование фрагментов Оказаки на вытесняемой цепи по принципу синтеза отстающей цепи;

>>> 30

<<< < Предыдущая 1 23 / 73 4 5 6 7 > Следующая >>>

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]