pneumoniae фаг СР-1. Эти фаги содержат линейные двуцепочечные ДНК-геномы, при репликации которых используется белковая затравка. Кроме того, при реплика­ции этих бактериофагов эксплуатируются механизмы «сползания» или «прыжка», в которых нуклеотиды вплоть до 30-го от 3'-конца используются в качестве матрицы для 50-го концевого нуклеотида, который остается ковалентно связанным с фаговым белком ТР.

Аденовирусы не единственный тип вирусов, использующий концевые повторы на концах геномной ДНК для реализации репликации. К таковым можно отнести и пар­вовирусы (лат. Parvoviridae, лат. parvus — маленький) — вирусы позвоночных и насе- комых. Весь жизненный цикл, включая сборку вириона, происходит в ядре клетки-хо­зяина. Геном парвовирусов представлен линейной оцДНК, состоящей из ~ 5000 ну­клеотидов. Интересной особенностью их геномов является наличие концевых повто­ров в 100–300 нуклеотидах, способных формировать шпильки. Эти повторы играют важную роль при репликации: благодаря им длина геномной ДНК не уменьшается. Поглощенный клеткой парвовирус доставляет свой геном в ядро, где оцДНК преоб­разуется в дц-форму ферментативной системой клетки-хозяина (рис. 26). Двуцепочеч­ная версия вирусного генома требуется для транскрипции и репликации. Репликация происходит только в растущих клетках. Вирусные белки синтезируются в цитоплазме и затем возвращаются в ядро, где собираются вирионы. В результате ядро и цитоплаз­ма клетки дегенерируют. Вирусы освобождаются в результате лизиса клетки.

русы, имеющие асимметричные шпилечные структуры, производят преимущественно оц(–)ДНК. В любом случае наблюдаются димерные репликативные промежуточные соединения. Роль транскрипционной матрицы играет RF-форма ДНК.

Репликация парвовирусов имеет ряд особенностей. Во-первых, этот процесс происходит по самозатравочному механизму и сразу начинается со стадии элонгации. Во-вторых, он осуществляется исключительно через синтез лидирующей цепи. В-тре­тьих, половина дочерних цепей ДНК аденосателлита имеет положительную, а другая половина — отрицательную полярность. В-четвертых, часть материнской молекулы ДНК входит в состав дочерней молекулы. В-пятых, внутри концевого повтора проис­ходит инверсия нуклеотидной последовательности; соответственно, нуклеотидные по­следовательности концевых повторов дочерних и материнских молекул различаются, но их структура сохраняется. В-шестых, подобные изменения не затрагивают смысло­вых нт-последовательностей (кодирующих и регуляторных) и не влияют на реплика­цию вируса.

Грамотрицательные бактерии, к которым относится E.coli, имеют оболочку, состо­ящую из слоя пептидогликана, окруженного двумя мембранами. Считается, что при ин­фицировании клетки фаг сначала взаимодействует с молекулами липополисахаридов, например с О- или К-антигенами, расположенными на поверхности бактериальной клет­ки, что обеспечивает правильную ориентацию хвостовой части фаговой частицы отно­сительно бактериальной оболочки. Дальше происходит необратимое взаимодействие фа­говых белков с теми же или другими бактериальными рецепторами, которое необходимо для инициации открытия хвостового канала вируса и интернационализации вирусной ДНК в клетку хозяина. Фаг T7 не исключение: он распознает рецепторы на поверхности клеток E.coli, прилипает к ним хвостовыми волокнами (рис. 27). В хвостовых волокнах некоторых штаммов T7 есть ферменты, специфически гидролизующие O- или K-антиге­ны липополисахаридов на поверхности клеткиE.coli. Процесс адсорбции и проникнове- ния идет с привлечением лизоцима для создания отверстия внутри пептидогликанового слоя стенки бактериальных клеток. Вместе с ДНК внутрь клетки также попадают белки, необходимые для начала репликации вирусного генома и расщепления генома клетки-хо­зяина. Как только вирусный геном попадает внутрь клетки, процесс репликации хозяй­ской ДНК прекращается и начинается репликация вирусного генома.

Физические данные о концевой избыточности (дуплицированности) последова­тельностей оснований получены из экспериментов, в которых ДНК фага подвергалась действию экзонуклеазы III. Этот фермент последовательно отщепляет нуклеотиды с 3'-конца цепи ДНК, в результате чего на концах дуплекса образуются 5'-оц-участки. Инкубация обработанных экзонуклеазой III молекул приводит к формированию коль­цевых структур. Если длина выщепленного фрагмента превышает длину повторяю­щегося участка, то в соединенной молекуле дуплексный сегмент оказывается между двумя оц-участками — брешами. Длина дц-сегмента, как и его состав, будет совпадать с длиной концевых повторов.

gp5

gp5

gp5

гатую область и сайт распознавания праймазы; синтез праймера начинается по направ­лению к А/Т-богатому региону «вправо». Когда оба промотора пройдены, инициация происходит во вторичных ori: одна молекула вирусной праймазы распознает сиквенс 5'-GGGTC-3', локализованный в А/Т-богатой области.

Во время более поздних раундов репликации вновь синтезированная ДНК обна­руживается в форме конкатемеров. Образование конкатемеров является своеобразным интермедиатом, через который реплицируется 3'-конец хромосомы T7. Конкатемеры по своей сути являются мультимерами хромосомы, связанными между собой по прин­ципу «голова к хвосту» через концевые «избыточные» последовательности. Интересно, что конкатемеры не образуются в том случае, когда активность РНК-полимеразы E.coli подавлена. Созревание и упаковка ДНК фага Т7 представляет собой сложный процесс с участием нескольких белков.

У фага Т7 обе цепи ДНК реплицируются прерывисто. Первые доказательства это­го факта были получены с использованием импульсного мечения. Цепи Т7 ДНК имеют разную плотность за счет различного содержания пуринов, поэтому их можно разде­лить в градиенте плотности CsCl в денатурирующих условиях, после чего иммобили­зовать на две колонки с метилированным альбумином-кизельгуром. После репликации фага в условиях импульсного мечения общий пул ДНК пропускали через одну колонку. В результате 50 % всех фрагментов осело на колонке. Оставшуюся фракцию пропуска­ли через вторую колонку. Оказалось, что остальные фрагменты осели на второй колон­ке. Таким образом, было показано, что фрагменты комплементарны обеим матричным цепям. Значит, фрагментарный синтез идет по обеим цепям.

Согласно принятой сегодня модели, при репликации ДНК фага Т7 происходит синтез лидирующей и отстающей цепей. Сценарий синтеза лидирующей цепи ДНК и обмена ДНК-полимераз в репликативной вилке T7 следующий. Репликативный комплекс формируется за счет взаимодействий C-конца gp4 с комплексом gp5/trx че­рез сайт gp5, обращенный по направлению движения вдоль оцДНК (рис. 29, в). Аль­тернативно комплекс gp5/trx может взаимодействовать с С-концом gp4 через TBD­сайт gp5. Формирование комплекса gp5/trx стимулирует инициацию синтеза ДНК. Сама по себе ДНК-полимераза фага Т7 не отличается высокой процессивностью и диссоциирует с ДНК после включения каждых 15–50 нт. Формирование комплекса с тиоредоксином увеличивает этот показатель до 800 нт. Как только начинается син­тез лидирующей цепи ДНК, формируется высокостабильный комплекс gp5/trx и gp4, увеличивающий общую производительность от 0,8 до ~ 5 тпн до диссоциации. Вза­имодействия С-конца gp4 со специфическим сайтом в gp5/trx дополнительно увели­чивает процессивность реплисомы от 5 до ~ 17 тпн. Таким образом, скорость синтеза

лидирующей цепи ДНК комплексом gp4–gp5/trx составляет 114 пн/с с процессивно­стью 17 тпн.

trx

trx

Брешь

Координация синтеза лидирующей и отстающей цепей происходит следую­щим образом. Во-первых, события, происходящие при синтезе лидирующей и от­стающей цепей, не эквивалентны. ДНК-полимераза многократно диссоциирует с запаздывающей цепи и удлиняет новый РНК-праймер после завершения синтеза ДНК каждого фрагмента Оказаки. Более того, одним из самых медленных собы­тий на отстающей цепи является узнавание праймазных сайтов праймазой и синтез РНК-затравки — 6–12 с. За это время на лидирующей цепи синтезируется около тысячи нуклеотидов. Есть две модели, объясняющие координацию этих процессов. Согласно первой, синтез лидирующей цепи приостанавливается до тех пор, пока не завершится синтез соответствующего фрагмента запаздывающей цепи; на это уходит ~ 12 с. При таком развитии событий петля на отстающей цепи должна высво­бождаться по сигнальному пути. Согласно второй модели, координация достигается за счет различных скоростей синтеза лидирующей и отстающей цепей. Исследо­вания скорости репликации E.coli, фагов T4 и T7 показали, что отстающая цепь синтезируется быстрее лидирующей на 38 %. Белок gp2.5 стимулирует активность gp4 и gp5 во время координированного синтеза ДНК и увеличивает частоту иници­ации синтеза по отстающей цепи более чем в 10 раз. Конкуренция между взаимо­действиями C-конца gp2.5 с gp5/trx и ДНК-геликазой во время координированного синтеза может как раз быть тем механизмом, с помощью которого комплекс gp5/trx высвобождается при синтезе одного фрагмента отстающей цепи и переключается на синтез нового фрагмента.