ность продукта, чтобы квалифицировать его именно как ДНК (критерий, которого до­стигли очень немногие исследователи на тот момент). Первоначально Корнберг забрал статьи, но они все равно были опубликованы в майском выпуске JBC 1958 г. после того, как сменился редактор [1, 2]. Эта работа принесла ему Нобелевскую премию по фи­зиологии и медицине в 1959 г., которую он раздел с Северо Очоа. Следующим шагом А. Корнберга станет синтез ДНК, которая обладает генетической активностью, и он будет заниматься ею на протяжении почти десяти лет.

вировать ДНК можно либо денатурацией щелочью или нагреванием (1), либо обработ­кой с помощью экзонуклеазы III из E.coli (2), либо внесением ников (одноцепочечных разрывов) с помощью различных эндонуклеаз (3). Во всех случаях матрицей для син­теза новых цепей будет служить одноцепочечная ДНК, а затравкой — 3'-гидроксильная группа на конце двуцепочечной ДНК, спаренной с матрицей. В том случае, если эндо­нуклеаза вносит одноцепочечный разрыв с формированием 3'-фосфатной группы, ДНК не является активированной.

Прямым доказательством того, что затравкой служит 3'-гидроксильный конец, является эксперимент с дидезоксинуклеозидтрифосфатом (рис. 8). Если использовать активированный нуклеотид, меченый по α-фосфату, то он будет включаться в расту­щую полимерную цепь и всегда обнаруживаться на ее 3'-конце. Это говорит о том, что он сам включается, но дальнейший рост цепи невозможен, так как нет 3'-гидроксиль­ного конца. Этот эксперимент также доказывает и униполярность репликации в на­правлении 5'→3'.

>>>  Метод ближайших соседей и антипараллельности репликации

В 1950–1953 гг. Эрвин Чаргафф определил количественное соотношение азоти­стых оснований, входящих в состав молекул ДНК. Он показал, что: а) общее коли­чество адениновых остатков в каждой молекуле ДНК равно количеству тиминовых остатков, а количество гуаниновых — количеству цитозиновых; б) мольное соотно­шение пуринов и пиримидинов равно 1; в) количество оснований с 6-аминогруппой равно количеству оснований с 6-кетогруппой; г) сумма частей 4 оснований равна еди­нице (А + Т) + (G + C) = 100 %. Также он ввел понятие видового индекса: соотноше­ние G + C/А + Т было названо коэффициентом специфичности. Также Чаргафф дока­зал, что ДНК обладает видовой специфичностью и отверг гипотезы о существовании многих разновидностей ДНК в живых системах. Правила Чаргаффа использовали Френсис Крик и Джеймс Уотсон при построении структурной модели ДНК в виде двойной спирали.

Ясно, что наиболее надежным доказательством идентичности структур синтезиро­ванной и исходной цепей ДНК при репликации явилось бы установление идентичности нуклеотидных последовательностей в этих молекулах. Однако, поскольку определение нуклеотидных последовательностей длинных отрезков ДНК на тот момент было еще нерешенной экспериментальной задачей, Корнбергу приходилось полагаться на менее прямые способы доказательства идентичности. Он разработал альтернативный подход к решению этой проблемы — так называемый метод определения частот ближайших соседей с привлечением [32P]-радиоактивно меченых изотопов по α-фосфатной группе в одном из 4 dNTP. Очевидно, что для нуклеиновой кислоты, содержащей четыре разных основания, существует 16 возможных комбинаций динуклеотидных последовательно­стей. Метод ближайших соседей состоит в определении абсолютной частоты, с которой каждая из этих динуклеотидных последовательностей встречается в исследуемом образ­це ДНК. Эксперимент состоит в следующем. После проведения синтеза в присутствии меченого α-dNTP конечная ДНК подвергается обработке смесью ДНКазы микрококков и диэстеразы селезенки до получения 3'-dNMP, после чего проводится анализ монону­клеотидного состава дочерней и матричной цепей ДНК. При подобной ферментатив­ной обработке ДНК 32Р изотоп остается на 3'-конце того нуклеотида, с которым исходно участвовал в формировании фосфодиэфирной связи меченый dNTP (рис. 9, а). При ана­лизе данных сравнивают частоту, с которой нуклеотид, исходно меченный по 5'-поло­жению, располагается возле соседнего нуклеотида вновь синтезированной цепи ДНК. Подобные расчеты проводят отдельно для каждого эксперимента с использованием од­ного меченого dNTP. Полученные данные позволяют сравнить частоту встречаемости каждого димера. Отдельно стоит отметить, что при анализе мононуклеотидов должны выполняться правила Чаргаффа для обеих цепей ДНК. Совокупность всех получен­ных Корнбергом данных позволила сформулировать следующие выводы. Во-первых,

в молекуле ДНК встречаются все 16 нуклеотидных последовательностей, но частота их встречаемости существенно зависит от источника ДНК (согласно видовому индек­су) и отличается от случайного распределения. Следовательно, расположение нуклео­тидов подчиняется определенной закономерности. Во-вторых, частота встречаемости отдельных динуклеотидов в матричной цепи совпадает с частотой их встречаемости в дочерней цепи. В-третьи, антипараллельность синтеза ДНК вытекает из следующих соображений. Частоты встречаемости димеров АрА и ТрТ, СрС и GpG совпадают. Со­ответствие остальных последовательностей зависит от того, как направлены цепи друг относительно друга. Например, для последовательности AGTC при прямой полярно­сти будет наблюдаться совпадение частот встречаемости в парах ApG и TpC или GpT и CpA, а при обратной полярности — в парах ApG и CpT или GpT и ApC (рис. 9, б). Из экспериментальных данных полярность получилась обратной. И, наконец, в-четвер­тых, после проведения «второго» раунда с использованием «горячей» матричной цепи и последующего анализа состава матричной цепи становится очевидным, что ДНК-по­лимераза синтезирует цепь ДНК антипараллельно и последовательность оснований в матрице при ферментативном синтезе полностью воспроизводится.

X XN

0,063

(появляется с частотой 0,1–0,4 % от основной ДНК-полимеразной активности);

4) эндонуклеазная активность. Если на пути фермента встречается короткий, ме­нее 10 нуклеотидов, неспаренный 5'-конец, то полимераза сначала проявляет эндону­клеазную активность и «откусывает» весь свисающий конец в месте перехода «одно­цепочечная — двуцепочечная ДНК», а затем проявляет экзонуклеазную 5'→3' актив­ность, т. е. «откусывает» по одному нуклеотиду. Если неспаренный 5'-конец длинный, то фермент способен использовать его как новую матрицу.

В 1960-х гг. Артур Корнберг продолжал заниматься изучением свойств открытой им ДНК-полимеразы I и сосредоточился на синтезе генетически активной ДНК, рабо­тая с различными бактериями. Это оказалось намного сложнее, чем просто копирова-

ние матричной ДНК, поскольку любое нарушение приводило к потере «жизнеспособ­ности» ДНК. При работе с крупными матричными молекулами ДНК в лабораторных условиях практически невозможно было избежать их повреждения. Именно поэтому А. Корнберг переключился на работу с некоторыми из самых маленьких бактериаль­ных вирусов — фагов, таких как φX174 и M13, паразитирующих в клетках E.coli. Их сравнительно небольшие геномы легче сохранять неповрежденными во время работы и их биологическую активность легко наблюдать в процессе проведения эксперимен­та. Роберт Синсхаймер обнаружил, что геном вируса φX174 представлен замкнутой кольцевой одноцепочечной ДНК, но сразу же после его попадания в клетку хозяина трансформируется в двуцепочечную форму. В отсутствие белков капсида эта ДНК сама по себе способна заразить другую бактериальную клетку. Аналогичная картина была обнаружена и для ДНК фага M13. Корнберг и его команда смогли синтезировать обе вирусные ДНК, но не в кольцевой, а в линейной форме. Оказалось, что вирулентна именно циклическая форма генома. Соответственно, возник вопрос о существовании фермента, способного сшивать свободные концы синтезированных нитей ДНК, а так­же любые разрывы в ДНК. В 1967 г. пять различных исследовательских групп, вклю­чая группу А. Корнберга, нашли фермент ДНК-лигазу. К концу этого года Корнберг синтезировал ДНК фага φX174 в такой же кольцевой форме. Она имела тот же состав, нуклеотидную последовательность и инфекционность, как и ДНК природного вируса.

Чтобы сообщить об этом, 14 декабря Корнберг и новостное бюро Стэнфорда провели пресс-конференцию, приуроченную к публикации исследований в журнале PNAS. Журналистов заранее предупредили, чтобы те не писали в заголовках о «син­тезированной в пробирке жизни». В конце концов, хотя синтез ДНК и был биохимиче­ским маркером, вирусная ДНК не имеет собственной формы жизни вне более крупной клеточной системы. В тот же день президент США Линдон Б. Джонсон должен был выступить в Смитсоновском институте, и его спичрайтер попросил Стэнфорд под­готовить представление о работе с ДНК. Текст был написан, но, когда Джонсон на­чал читать подготовленное заявление, он резко отложил его и сказал своей аудитории: «Некоторые гении в Стэнфордском университете создали жизнь в пробирке!» К ужа­су Корнберга, все газетные статьи о его работе на следующий день начались именно с этого заявления.

• γ-комплекс, который обеспечивает загрузку реплисомы при репликации фраг­ментов Оказаки на отстающей цепи. Гамма-комплекс состоит из γ-субъединицы, ко­дируемой геном dnaX; 3 τ-субъединиц, также кодируемых геном dnaX, за счет которых мультимеризуется core-фермент; 3 субъединиц δ и δ', кодируемых генами holAи holB соответственно; δ-субъединица принимает непосредственное участие в синтезе отста­ющей цепи;