Праймирование репликации ДНК фагов G4 и ФX174. Праймаза и праймосома

Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

Репликация ДНК прокариот и вирусов. Учебное пособие.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

08.09.2026

Размер:

2 Мб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 1 2 34 / 74 5 6 7 > Следующая >>>

>>> Жизненный цикл фага М13. Репликация фаговой ДНК. Модель катящегося колеса

– завершение репликации на обеих цепях; – вытеснение кольцевой ДНК.

Репликация инициируется в суперскрученном состоянии дцДНК фага при узнавании белком Rep ori-сайта DSO, double-strandorigin (рис. 19). В данном случае суперспирализация важна для инициации процесса как invivo, так и invitro. Это состояние облегчает расплавление ori по АТ-богатому участку. DSO имеет три локуса: сайт связывания с белком Rep, сайт для внесения разрыва, ника, и терминаторный энхансер (рис. 19, 1). Расстояние между вторым и третьим локусами важно для регу- ляции активности Rep. Последовательность ник-локуса очень консервативна среди плазмид, принадлежащих к одному семейству. Разрыв, сиквенс-специфически вносимый нуклеазой Rep в DSO, обеспечивает существование свободного 3'-OH конца для инициации работы pol III E.coli. При этом с 5'-концом связывается Rep (он же инициаторный белок), который помогает вытеснять цепь из дуплексной части и либо остается ковалентно связанным с 5'-концом ДНК за тирозин, либо оказывается связан с ней нековалентными взаимодействиями (зависит от типа плазмиды) (рис. 19, 2). Плавление ДНК-дуплекса обеспечивается геликазой PcrAE.coli. Третий бактериальный белок, необходимый для корректной репликации фагового генома, — это SSB, который немедленно покрывает оцДНК, вытесненную из дуплекса в процессе синтеза лидирующей цепи (рис. 19, 3). Схематично можно представить себе это как нить, скатывающуюся с круга катушки. По ходу синтеза образуется конкатемерные структуры — связанные между собой цепи ДНК (рис. 19, 4). Терминация синтеза обеспечивается в том числе за счет формирования полного дцДНК-продукта, оцДНК-интермедиата и формирования гетеродимера Rep с 1 интактной и 1 ковалентно связанной субъединицей, которая не способна инициировать синтез лидирующей цепи (рис. 19, 5).

Синтез лидирующей и отстающей цепей разобщен. Плазмидная ДНК имеет в своем составе два типа ori: DSO, о котором речь уже шла выше, инициирующий синтез лидирующей цепи, и SSO, single-strandorigin, инициирующий синтез отстающей цепи (рис. 20, а). Как правило, SSO локализован в высокоструктурированном некодирующем регионе, обладающем специфической вторичной структурой. Формирование дцДНК-копий происходит следующим образом. Тут задействован исключительно репликативный аппарат клетки-хозяина. Сначала Rep производит разрыв, терминируя тем самым синтез лидирующей цепи. Затем РНК-полимераза и pol III реплицируют одноцепочечную ДНК, стартуя с SSO, с формированием нового двуцепочечного кольца. После этого pol I заменяет РНК-праймер на ДНК-фрагмент, а ДНК-лигаза сшивает концы, образуя тем самым окончательную двуцепочечную ДНК.

Каким же образом происходит инициация репликации отстающей цепи фаговой частицы? В районе SSO ori имеет 4 шпильки (рис. 20, б). Эти шпильки опознаются РНК-полимеразой как собственный ori, и вторая шпилька с палиндромной последовательностью используется в качестве матрицы. По мере образования РНК-праймера шпилька плавится. Синтезируется РНК-затравка длиной 24 нт, 3'-конец которой используется pol III в качестве затравки. При терминации 3'-конец синтезируемой цепи ДНК «утыкается» в РНК-затравку.

>>> 31

>>>

Геномная организация плазмид, реплицирующихся по принципу катящегося колеса, очень консервативна. Процесс транскрипции таких плазмид часто сопряжен с репликацией, но гены устойчивости к антибиотикам чаще транскрибируются отдельно. Количество копий фагового генома регулируется аутогенно на стадии инициации репликации. Число копий плазмиды может меняться в зависимости от типа клетки-хозяина. Обычно в одних и тех же условиях внутри данной клетки число копий фага постоянно: около 20. Достигается это в основном за счет регуляции концентрации/активности Rep как скорость-лимитирующего фактора или других элементов, кодируемых плазмидой; это могут быть как цис-, так и транс-регуляторные элементы. Контроль уровня Rep осуществляется на нескольких уровнях. Во-первых, с помощью нуклеиновых взаимодействий: инициация репликации лидирующей цепи регулируется с помо-

5’-p-Tyr

SSO

DSO

3’-OH

>>> 32

Рис.19. Модель катящегося колеса: активация DSO (адаптирована из[18])

>>> Праймирование репликации ДНК фагов G4 и ФX174. Праймаза и праймосома

щью антисенс-РНК к гену Rep. Во-вторых, на уровне белок-белковых взаимодействий: терминация репликации приводит к формированию димера Rep с одной неактивной субъединицей. В-третьих, на уровне белок-нуклеиновых взаимодействий: существует целый пул малых фаговых белков, которые предотвращают утилизацию DSO-ori или осуществляют дополнительную регуляцию транскрипции гена Rep.

Репликация по типу катящегося кольца нашла широкое применение как в академических исследованиях, так и в биотехнологии, и этот механизм был успешно использован для амплификации ДНК из очень небольших количеств ДНК исходного образца.

ба

pol III

DSO

SSO

РНК pol

Рис.20. Модель катящегося колеса: относительное

расположение (а) иструктура SSO (б)

РНК

ПРАЙМИРОВАНИЕ РЕПЛИКАЦИИ ДНК ФАГОВ G4ИФX174. ПРАЙМАЗА ИПРАЙМОСОМА

Еще два бактериофага, поражающие клетки E. coli, — φX174 и G4. Геном фага φX174 представлен оцДНК длиной 5386 нуклеотидов, первый в истории секвениро-

ванный геном в 1976 г., в 2003 г. полностью собран из олигонуклеотидов invitro. Фаг G4 был выделен из сточных вод в 1974 г. Его изометрический капсид содержит геном в форме оцДНК размером ~ 5,5 тпн. На сегодняшний день геном фага также собран invitro. Фаг G4 имеет высокое генетическое и структурное сходство с фагом φX174, хотя различие в последовательности двух фаговых геномов составляет около 39 %.

Поскольку геномы этих фагов представлены оцДНК, то сразу стоит упомянуть о том, что такая форма ДНК сама по себе крайне лабильна к действию ферментов и ак-

>>> 33

>>>

тивных радикалов кислорода. Именно поэтому оцДНК находится в связанной со специфическим белком форме. Такие белки называются SSB,

single-strand binding, т. е. связывающие оцДНК. Эти бел-

ки не имеют каталитической активности, но обладают крайне высокой аффинностью по отношению к оцДНК за счет кластера положительно заряженных аминокислот

Рис.21. Схематическое изображение комплекса SSB

сдуплексом ДНК

(рис. 21). С противоположной стороны белковая молекула имеет мощный кластер отри-

цательно заряженных аминокислот, что обеспечивает взаимодействие SSB с сахарофосфатным остовом ДНК и не дает молекуле оцДНК, покрытой SSB, схлопнуться в дц-форму. Еще одной характеристикой белков этого класса является их положительная кооперативность. В биохимии под кооперативностью понимают изменение свойств совокупности белковых молекул при связывании с лигандом по сравнению со свойствами, проявляемыми этими же молекулами при связывании с лигандами в индивидуальном состоянии. Положительная кооперативность SSB проявляется в увеличении сродства молекулы белка к комплексу SSB/ДНК по сравнению со сродством к ДНК индивидуальной молекулы белка. SSB обнаружены в организмах всех классов. Они обладают различной доменной и субъединичной организацией, могут видоспецифически регулировать активность ДНК-полимераз (например, SSB T4 избирательно стимулирует активность ДНК-полимеразы фага Т4). Некоторые типы SSB более подробно будут рассмотрены ниже.

В отличие от репликативного цикла фага М13, процесс репликации ДНК фага φX174 не ингибируется рифампицином. Соответственно, здесь должна работать не обычная РНК-полимераза, а особый фермент — праймаза. В E.coli,а также Bacillus stearothermophilus и Mycobacteriumtuberculosis праймаза кодируется геном dnaG, про- дукт которого содержит 581 ак и имеет массу 65,5 кДа. Этот моносубъединичный белок имеет в своем составе Zn-палец, необходимый для реализации белок-нуклеиновых взаимодействий. Каталитическая стадия требует наличия ионов Mg2+ в качестве кофактора. Праймаза взаимодействует с геликазой DnaB — ферментом, денатурирующим дцДНК. Геликазо-праймазный комплекс состоит из трех субъединиц DnaG, связанных с одним гексамером DnaB, и инициирует синтез фрагментов Оказаки при репликации бактериальной хромосомы, а также синтез ДНК на лидирующей цепи (рис. 22, 2, 3). Длина РНК-затравки может варьировать в пределах от 10 до 60 нуклеотидов, однако большинство синтезированных олигонуклеотидов являются 12-звенными. Праймаза сама по себе не садится на ДНК. Для этого ей нужны дополнительные факторы — бел-

>>> 34

>>> Праймирование репликации ДНК фагов G4 и ФX174. Праймаза и праймосома

ки препрайминга PriA, PriB, PriC, которые обеспечивают узнавание специфической шпильки и привлечение в это место собственно праймазы в составе праймосомного комплекса (рис. 22, 1). Праймосома представляет собой белки препрайминга и прай-

PriA PriB PriC

SS (+)

1 2

SSB

ATP

DnaB

DnaC

Праймаза

(–)

RF I (+)

ATP

ADP + Pi

pol III

Рис.22. Механизм репликации ДНК фагов φХ174 и G4

>>> 35

>>>

мазно-геликазный комплекс. В месте шпильки SSB-белки диссоциируют с ДНК. Праймаза АТР-зависимо синтезирует РНК-праймеры в нескольких местах оцДНК на расстоянии ~ 1000 нуклеотидов друг от друга, после чего pol III-holo E.coli синтезирует полную (–)-цепь для формирования дцДНК-RF вируса (рис. 22, 4, 5). Процесс заверша- ет подключение pol I и ДНК-лигазы (рис. 22, 6). Дальше идет ассиметричный синтез (+)-цепей и сборка капсида.

Аналогичным образом с привлечением праймазы и белков препрайминга образуются РНК-затравки при репликации ДНК E.coli. Все эти белки, так же как и остальные ферменты, задействованные в репликации репликативной формы ДНК фага, принадлежат клетке-хозяину.

РЕПЛИКАЦИЯ ДНК АДЕНОВИРУСА

Аденовирусы — семейство неинвазивных ДНК-содержащих вирусов позвоночных с икосаэдрическим нуклеокапсидом, лишенных липопротеиновой оболочки. Их название происходит от первоначального выделения из аденоидов человека в 1953 г. Частицы аденовирусов с молекулярной массой ~ 150·МДа имеют диаметр 70–90 нм, их геном представлен одной копией линейной несегментированной дцДНК длиной 26–48 (36) тпн с концевым повторяющимся участком ~ 100 нуклеотидов. Интересной особенностью вируса является наличие на каждом 5'-конце молекулы ДНК концевого белка ТР (terminalprotein) 55 кДа. Они используются в качестве затравки при реплика- ции вируса, а также являются гарантией того, что концы линейного генома будут реплицироваться адекватно. Вирус попадает в клетку через эндосому, т. е. без дополнительного слияния. Выживаемость и репликация вируса зависят от систем клетки-хозяина. Репликация аденовирусов — очень эффективный процесс. В течение 40 ч инфицированная клетка продуцирует около миллиона копий вирусной ДНК. Наиболее изучены аденовирусы, вызывающие острые респираторные заболевания, особенно у людей с ослабленным или нарушенным иммунитетом. На материале аденовирусов было открыто явление альтернативного сплайсинга. Они относительно устойчивы во внешней среде, инактивируются лишь при прогревании до 56 °С и обработке растворами хлорамина и фенола. Аденовирусы хорошо размножаются на культурах тканей человека и животных. Используются в качестве вирусного вектора при генной терапии благодаря своей способности размножаться в реплицирующихся и нереплицирующихся клетках. На основе аденовирусов конструируют векторы для лечения онкологических заболеваний.

Собственно проникновение в клетку-хозяина инициируется выступающим доменом фибриллярного белка, связывающегося со специфическим клеточным рецептором (рис. 23). Как только вирус оказался внутри клетки-хозяина, происходит закисление эндосомы, возможно, за счет действия вирусного интегрина αvβ5, что изменяет топологию вируса, вызывая распад компонентов капсида. Эти изменения, а также токсичность пентонов — белков капсида аденовируса — разрушают эндосому, приводя к высвобождению вириона в цитоплазме. С помощью клеточных микротрубочек вирус

>>> 36

>>> Репликация ДНК аденовируса

Клеточная мембрана

Вирусная

частица

Цитоплазма

Эндоцитоз

Ядро

Проникновение

в цитоплазму

Транскрипция поздних генов

рН

Ранние регуляторные белки

РАННЯЯ ФАЗА

Транскрипция ранних генов

ПОЗДНЯЯ ФАЗА

Репликация вирусной ДНК

Поздние структурные белки

Ассоциация вирусных частиц

Рис.23. Жизненный цикл аденовирусов

>>> 37

>>>

переносится в ядерную пору, из-за чего вирусная частица разбирается. Соответственно, свободная вирусная ДНК попадает в ядро через ядерную пору. После этого ДНК ассоциирует с молекулами гистонов. Таким образом, начиная с этого момента, экспрессия вирусного генома может стартовать и становится возможной генерация новых вирусных частиц.

Жизненный цикл аденовируса разделяется процессом репликации ДНК на две фазы: раннюю и позднюю (см. рис. 23). В обеих фазах генерируется первичный транскрипт вирусной мРНК, который подвергается альтернативному сплайсингу для генерации моноцистронных мРНК, совместимых с рибосомой хозяина, что позволяет синтезировать вирусные белки с помощью хозяйской системы трансляции. Как только с помощью трансляции ранних генов происходит наработка вирусных белков, необходимых для начала репликации, собственно репликация может стартовать. Для этого нужны три аденовирусных белка, кодируемых генами региона Е2: рТP, аденовирусная ДНК-полимераза и ДНК-связывающий белок DBP, а также два белка клетки-хозяина: транскрипционные факторы NFI и Oct-1. ДНК-связывающий белок DBP играет роль геликазы: он способен инициировать раскручивание дуплекса ДНК за счет формирования мультимеров DBP/ДНК без участия АТР. Кроме того, этот белок влияет на сродство ТP к первому нуклеотиду, а также увеличивает скорость и процессивность вирусной ДНК-полимеразы.

Вирусная ДНК содержит два идентичных ori ~ 1–50 пнт, локализованных в участке с концевым повторами (рис. 24, а) [19]. Концевые 18 пнт формируют минимальный ori, а остальные пары — вспомогательный. Сначала клеточные транскрипционные факторы NFI и Oct-1 связываются со вспомогательным ori, что увеличивает скорость инициации репликации в несколько сотен раз. Синтез праймированного белком 5'-конца ДНК начинается с ковалентного присоединения dCMP к 80 кДа-прекурсору ТP, рТP (например, в HAdV-5 присоединение по Ser580), после чего вирусная ДНК-полимераза катализирует синтез ДНК с вытеснением цепи только по одной матрице, в отличие от стандартного синтеза дцДНК (рис. 24,б). Множественные взаимодействия между тремя вирусными и двумя клеточными белками и ori участвуют в формировании комплекса преинициации. Этот шаг сопровождается незначительными изменениями структуры ori при связывании DBP и возникновением достаточно большого изгиба ДНК, главным образом вызванного ассоциацией с NFI и Oct-1. Инициирование происходит в позиции 4 (3'-G1TAG4TA) с последующим образованием промежуточного продукта pTP-CAT (см. рис. 24,б). Этот продукт является комплементарным начальному участку, соответственно, он «разворачивается» и становится спаренным с матричными остатками 1–3. Этот механизм «отката» объясняет наличие короткой 3 пнт (иногда 2 или 4 пнт) повторной последовательности в первых 10 пнт всех ori аденовирусов. Непосредственно во время или вскоре после «отката» ДНК-полимераза диссоциирует с pTP, что приводит к увеличению скорости полимеризации и коррекции. Дальнейшая разборка комплекса преинициации происходит в начале инициации, в тот момент, когда диссоциирует NFI; Oct-1 диссоциирует только тогда, когда при прохождении репликативной вилки сайт узнавания становится одноцепочечным. Три-штрих-конец pTP-CAT эффективно удлиняется вирусной ДНК-полимеразой в комплексе с DBP, что приводит к образованию

>>> 38

>>> Репликация ДНК аденовируса

pTP

pTP/Pol

А/Т-

Минимальный регион Вспомогательный регион

регион

NFI Oct-1

Pol

pTP

Pol

pTP

Pol

pTP

Рис.24. Структура ori аденовируса (а). Взаимодействия между рТР иДНК-полимеразой

приинициации репликации аденовируса (б) [19]

>>> 39

>>>

нового дуплексного генома и вытеснению нематричной цепи ДНК из нового дуплекса (рис. 25, а). В финальной стадии репликации рТP расщепляется вирусной протеазой до ТP. Таким образом, формируется дочерняя цепь ДНК, которая может упаковываться в вирион. Вновь синтезированная дцДНК аденовируса, образованная путем репликации либо при отжиге комплементарных цепей, может выступать в качестве стартовой молекулы ДНК при инициации еще одного раунда репликации или инкапсулироваться в вирионы (рис. 25, б).

Pol

pTP

Pol

pTP

Рис.25. Механизм репликации аденовируса

pTP

Pol

pTP

Во время последней фазы жизненного цикла аденовируса происходит наработка достаточного количества структурного белка для упаковки всего генома. После того как вирусные компоненты успешно реплицируются, вирус собирается в белковые оболочки и высвобождается из клетки в результате лизиса.

Аденовирус способен к множественной реактивации (multiplereactivation, MR) — это процесс, посредством которого два или более вирусных генома, содержащих летальное количество повреждений ДНК, взаимодействуют внутри инфицированной клетки-хозяина с образованием нового жизнеспособного вирусного генома. Есть мнение, что MR — общая форма полового взаимодействия, которая обеспечивает преимущество при выживании поврежденного генома.

Несмотря на то что механизм репликации ДНК аденовируса является уникальным среди эукариотических вирусов, он имеет много общего с процессом репликации белок-праймированных ДНК некоторых бактериофагов, таких как бактериофаги Bacillussubtilis f29 и GA-1, бактериофаг Escherichiacoli PRD1 и Streptococcus

>>> 40

<<< < Предыдущая 1 2 34 / 74 5 6 7 > Следующая >>>

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]