Стоит отметить, что SSB-белки связывают и дц-форму ДНК, но разница в аффин­ности достигает 104 раз. В общем случае SSB не способны понижать температуру плав­ления дцДНК или денатурировать дуплекс. Их способность различать оц- и дц-формы ДНК основана на ограничении объема в центре ДНК-связывающей «щели» за счет нали­чия ароматических аминокислот; для gp32 это остатки Phe183 и Tyr186. Разупорядочен-

Связывание гиразы является специфическим; в ДНК E. coli было об­наружено 2 специфических сайта с консенсусной последовательностью 5'-RNNNRNNRTGRYCTYNYNGNY-3' (21 нт) (R — пурины, Y — пиримидины, N — любой). Было установлено, что разрыв происходит между нуклеотидами TG (выделено выше). Во всем геноме E. coli предположительно есть около 45–50 крупных сайтов связывания с ДНК-гиразой, однако не все они функциональны. Имеется также почти 10 тыс. сайтов, характеризующихся более слабым связыванием гиразой. Это означает, что крупные сайты составляют приблизительно 0,5 % от всех возможных сайтов свя­зывания. Однако даже эти сайты в подавляющем большинстве случаев не проявляют никакой активности и работают лишь тогда, когда концентрация гиразы чрезвычайно высока.

Инициация. Условия среды, которые поддерживают быстрый рост бактерий, так­же соответствуют и более короткому времени инициации репликации в них, т. е. вре­мя удвоения ДНК в быстрорастущих клетках меньше по сравнению с медленнорасту­щими клетками. Другими словами, вполне возможно, что в условиях быстрого роста исходные клетки начнут повторно реплицировать свою ДНК во время предыдущего раунда репликации. По этой причине начало репликации должно подвергаться стро­гой регуляции. У бактерий сборка реплисомы в месте ori регулируется ассоциацией белок-нуклеинового комплекса. OriC представляет собой регион ~ 260 пн, который содержит 13–16 пн (в зависимости от вида) АТ-богатый участок — DNAunwinding element (DUE) и множественные сайты посадки белка DnaA (рис. 35). Это относи­тельно небольшой белок с молекулярной массой 52,5 кДа, содержащий 467 ак. В ге­номе E.coliесть 11 сайтов АТР-зависимого связывания DnaA, три из которых — R1, R2 и R4 — обладают крайне высокой аффинностью к DnaA; они имеют консерватив­ную 9-нуклеотидную консенсусную последовательность 5'-TTAT(C/A)CACA. DnaA существует с двух формах: активной DnaA-ATP и неактивной DnaA-ADP. Обе формы с одинаковым сродством связываются с высокоаффинными участками на протяжении большей части клеточного цикла. Эти сайты представляют собой специфическое ме­сто, в котором формируется реплисома, т. е. комплекс, осуществляющий репликацию. Остальные восемь сайтов связываются с DnaA-ATP с более низкой аффинностью. Во время инициации DnaA связывается с высокой аффинностью с сайтом R4, «па­дает» на соседний сайт с низкой аффинностью и постепенно заполняет все сайты. Таким образом, связывание DnaA с oriC напоминает кооперативные взаимодействия. Связывание с этими сайтами изменяет нативную конформацию ori. Предполагается, что вызванное связыванием с DnaA появление оцДНК способствует разделению це­пей, что позволяет большему количеству DnaA связываться с раскрученной областью (рис. 36). Затем «погрузчик» геликазы DnaC взаимодействует с DnaA, связанным с оцДНК, и привлекает геликазу DnaB, которая, собственно, и раскручивает ДНК-ду­плекс, до тех пор пока активируемая ею праймаза DnaG в составе праймосомы (с ге-