Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Репликация ДНК прокариот и вирусов. Учебное пособие.pdf
МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РФ
НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
Факультет естественных наук
Е. А.Белоусова,Г. М.Дымшиц
РЕПЛИКАЦИЯ ДНК ПРОКАРИОТ ИВИРУСОВ
Учебное пособие
Новосибирск
2021
УДК 577.21
ББК 28.070
Б 435
Рецензент
канд. хим. наук, проф. С.Д.Мызина
Белоусова, Е. А.
Б 435
Репликация ДНК прокариот и вирусов : учеб. пособие / Е. А. Белоусова,
Г. М. Дымшиц; Новосиб. гос. ун-т. — Новосибирск : ИПЦ НГУ, 2021. — 70 с.
ISBN 978-5-4437-1158-4
Пособие представляет собой развернутое описание одного из основных молекулярно-генетических процессов, обеспечивающих воспроизведение генетической информации прокариот и вирусов, — репликации. Особое внимание уделено
описанию набора функциональных элементов, обеспечивающих регуляцию процесса репликации. Частично освещает курс «Механизмы репликации, транскрипции, трансляции».
Предназначено для студентов естественно-научных факультетов университетов и других специальностей вузов, требующих углубленного знания биохимии
и молекулярной биологии, а также для самостоятельно изучающих матричные
процессы биосинтеза.
УДК 577.21
ББК 28.070
Рекомендовано к печати
кафедрой молекулярной биологии ФЕН НГУ (протокол от 19.10.2020 г.)
© Новосибирский государственный
университет, 2021
ISBN 978-5-4437-1158-4 © Е. А. Белоусова, Г. М. Дымшиц, 2021
ПРИНЦИПЫ РЕПЛИКАЦИИ
Репликáция ДНК — ферментативный процесс синтеза дочерних молекул дезок-
сирибонуклеиновой кислоты по матрице родительской молекулы ДНК. Этот процесс
происходит во всех живых организмах, кроме РНК-содержащих вирусов, и является основой наследования генетической информации. В результате этого сложного процесса,
осуществляемого комплексом ферментов и не обладающих каталитической активностью белков, необходимых для придания полинуклеотидным цепям нужной конформации, образуются две идентичные двойные спирали ДНК. В ходе последующего деления материнской клетки каждая дочерняя клетка получает по одной из копий молекулы
ДНК. Этот процесс обеспечивает точную передачу генетической информации из поколения в поколение. В 1959 г. Артур Корнберг и Северо Очоа получили Нобелевскую
премию по физиологии и медицине «за открытие механизмов биосинтеза РНК и ДНК».
Процесс репликации ДНК основан на принципах комплементарности,антипа-
раллельностииуниполярности(рис. 1).
Материнские цепи
5'
T
C
A
G
T
C
A
G
T
G
3'
3'
A
G
T
C
A
G
T
C
A
C
5'
Рис.1. Принципы репликации: комплементарность, антипараллельность,
5'
T
C
A
G
T
C
A
G
T
G
униполярность иполуконсервативность
5'
T
C
A
G
C
T
A
C
G
A
T
C
A
C
5'
3'
5'
5' 5'
3'3'
Дочерние цепи
3'
T
C
A
G
T
C
A
G
T
G
A
G
T
C
A
G
T
C
A
C
5' 5'
3'
3'
T
C
A
G
T
C
A
G
T
G
A
G
T
C
A
G
T
C
A
C
Принципкомплементарности реализуется за счет того, что каждая из двух цепей
«материнской» молекулы ДНК служит матрицей для синтеза дополняющей ее, т. е. комплементарной, «дочерней» цепи.
>>> 3
>>>
Принципантипараллельности постулирует, что каждая цепь ДНК имеет опреде-
ленную ориентацию. Один конец несет гидроксильную группу, ОН, присоединенную
к 3'-углероду в сахаре дезоксирибозы; на другом конце цепи находится остаток фосфорной кислоты в 5'-положении. Две комплементарные цепи в молекуле ДНК ориентированы в противоположных направлениях — антипараллельно. Синтезируемая дочерняя
цепь направлена антипараллельно матричной, т. е. напротив 3'-конца матричной цепи
находится 5'-конец дочерней.
Униполярность заключается в том, что наращивание каждой цепи при синтезе но-
вой нити ДНК возможно лишь в одном направлении: от 3'-концов к 5'-концам матричных
цепей. При этом синтез комплементарных нитей всегда ведется в направлении 5'→3'.
ДНК-полимеразы могут давать «задний ход», т. е. двигаться в направлении 3'→5'.
В том случае, когда последнее добавленное при синтезе нуклеотидное звено оказалось
некомплементарным нуклеотиду матричной цепи, оно будет замещено комплементарным нуклеотидом. Отщепив «неправильный» нуклеотид, ДНК-полимераза продолжает
синтез в 5'→3' направлении. Такая способность к исправлению ошибок получила название «корректорская функция фермента».
Кроме этих общих для всех матричных процессов принципов, для репликации ха-
рактерны и другие, связанные с уникальностью строения молекул ДНК. Одним из них
являетсяполуконсервативность. В ходе процесса репликации двойная спираль ДНК
разделяется на отдельные цепочки, каждая из которых служит матрицей для построения
новой, «дочерней» нити. В результате образуются две идентичные двойные дочерние
спирали, в каждой из которых одна из цепей — сохраненная, «законсервированная»,
материнская, та, которая представляла собой половину материнской молекулы. Вторые
цепи дочерних молекул — новые, синтезированные из дезоксирибонуклеотидов заново
по принципу комплементарности к нитям материнской ДНК. Новые молекулы двуцепочечной ДНК ничем не отличаются друг от друга и от материнской двойной спирали.
Следующий базовый принцип репликации — еепрерывистость. Для того чтобы
новые нити ДНК были построены по принципу комплементарности, двойная спираль
должна быть раскручена, между родительскими цепями должны отсутствовать водородные связи. Только в этом случае ДНК-полимеразы, т. е. ДНК-синтезирующие ферменты, способны двигаться по материнским нитям и использовать их в качестве матрицы
для безошибочного синтеза дочерних цепей. Что касается эукариот, то длина каждой молекулы ДНК любой клетки очень велика, она превышает размеры самой клетки во много
раз. Например, длина каждой из 46 молекул ДНК соматической клетки человека составляет примерно от 2 до 10 см, в них содержится от 5 до почти 30 млн витков спирали! Раскрутить столько витков от начала до конца невозможно. В этом случае репликация самой
короткой 2-сантиметровой молекулы от одного конца до другого длилась бы почти две
недели. На деле же процесс репликации занимает всего от нескольких минут до нескольких часов, в зависимости от размера генома и типа клетки. Полное раскручивание спиралей, состоящих из многих миллионов пар нуклеотидов, сопряжено со столь значительным количеством вращений и такими энергетическими затратами, которые невозможны
в условиях клетки. По этой причине репликация начинается одновременно в нескольких
местах молекулы ДНК. Участок между двумя точками, в которых заканчивается синтез
>>> 4
>>> Принципы репликации
дочерних цепей, называется репликоном(рис. 2). Старт репликации происходит в центре репликона. В зависимости от размера генома каждая молекула ДНК может иметь
от одного (например, ДНК E.coli) до нескольких десятков тысяч репликонов (например,
каждая хромосома человека содержит ~ 25000 репликонов). В каждом репликоне есть
одна, если репликон однонаправленный, или две, если репликон двунаправленный, репликативные вилки — место перехода двуцепочечной ДНК в одноцепочечную форму.
Этот процесс разделения двух цепей одной молекулы ДНК происходит под действием
специализированных ферментов — геликаз. Каждая нить служит матрицей для синтеза комплементарной дочерней цепи. Именно в репликативной вилке работает ферментативный комплекс, обеспечивающий репликацию ДНК. Поскольку ДНК-полимеразы
могут катализировать синтез ДНК только в одном 5'-3'-направлении, а две цепи одной
молекулы ДНК ориентированы антипараллельно, то в каждой репликативной вилке
идет одновременный синтез двумя различными ферментативными комплексами. Одна
дочерняя цепь растет непрерывно и называется лидирующей, а вторая — запаздываю-
щей, первоначально синтезируется в виде отдельных фрагментов, названных по имени
открывшего их японского ученого Оказаки. После синтеза отдельные фрагменты процессируются набором ферментов с образованием целой цепи ДНК. Подобный механизм
синтеза дочерних цепей называется прерывистым (рис. 3).
5'
3'
5'
3'
Лидирующая
цепь
Отстающая
цепь
Ori
Движение
репликативной
вилки
Праймер
Репликон
Рис.2. Принципы репликации: прерывистость ипотребность взатравке.
Строение репликона, направление движения репликативных вилок
>>> 5
>>>
И последний принцип репликации — потреб-
ность в затравке. Ни одна
из существующих репли-
Синтез
лидирующей
цепи
Праймер
Синтез
фрагмента
Оказаки
Рис.3. События врепликативной вилке:
непрерывный синтез лидирующей цепи исинтез
фрагментов Оказаки запаздывающей цепи
лимеразой, — 10–12 нуклеотидов. Выполнивший свою функцию праймер, РНК-затравка, удаляется специальным ферментом, а образованная при этом брешь заделывается
ДНК-полимеразой, использующей в качестве затравки 3'-ОН конец соседнего фрагмента Оказаки. Завершается процесс созревания отстающей цепи ДНК после сшивания
фрагментов Оказаки ферментом ДНК-лигазой.
Синтез
отстающей
цепи
кативных ДНК-полимераз
не начинает синтез ДНК
лидирующей цепи и синтез
фрагментов Оказаки отстающей цепи de novo, т. е.
с нуля. Они могут лишь наращивать уже имеющуюся
полинуклеотидную цепь,
последовательно присоединяя дезоксирибонуклеотиды
к ее 3'-ОН концу. Откуда же
берется начальный 5'-концевой участок растущей цепи?
Его синтезирует особая полимераза — ДНК-зависимая
РНК-полимераза, или праймаза (от англ. primer — затравка). Размер рибонуклеотидной затравки невелик
в сравнении с размером цепи
ДНК, образуемой ДНК-по-
ДОКАЗАТЕЛЬСТВА ПОЛУКОНСЕРВАТИВНОГО
МЕХАНИЗМА РЕПЛИКАЦИИ ДНК ИХРОМОСОМ
Половина того, что мы знаем, неправда.
Цель ученого втом, чтобы определить какая именно.
А. Корнберг
Каждая молекула ДНК представляет собой спираль, состоящую из двух ком-
плементарных друг другу цепей ДНК. Одна из цепей дуплекса является исходной
>>> 6
>>> Доказательства полуконсервативного механизма репликации ДНК и хромосом
родительской молекулой, а другая — цепью, вновь синтезированной в ходе процесса
репликации. Такой механизм образования ДНК-дуплекса или репликации называется полуконсервативным. В настоящее время этот механизм считается доказанным
благодаря опытам Мэтью Мезельсона и Франклина Сталя, проведенным в 1958 г.
Ранее существовали и две другие модели: «консервативная», предполагающая, что
в результате раунда репликации образуется одна полностью родительская молекула
ДНК и одна полностью дочерняя; «дисперсионная», предполагающая, что все получившиеся в результате репликации молекулы ДНК мозаичны, т. е. имеют в своем
составе как вновь синтезированные, так и взятые из родительской молекулы ДНК
участки.
Мезельсон и Сталь изучали изменение молекулярной массы и парциального
удельного объема ДНК с помощью равновесного ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия с использованием изотопов азота 14N и 15N (рис. 4, а).
15
N не радиоактивен, а лишь тяжелее 14N. Содержащие тяжелый изотоп молекулы
ДНК функциональны и могут принимать участие в процессе репликации. Мезельсон
и Сталь выращивали нескольких поколений бактерий E. coli в среде, обогащенной
тем или иным изотопом азота, затем обрабатывали клетки додецилсульфатом натрия
для разрушения бактериальной клеточной стенки и центрифугировали лизат в градиенте плотности хлористого цезия при 140 000 g в течение 20 ч. При таком центрифугировании молекулы ДНК хорошо отделялись от остальных макромолекулярных компонентов, достигали седиментационного равновесия и обнаруживались при плотности
1,71 г/см3. Положение полос определяли по поглощению УФ-части спектра. В данном
случае более тяжелая 15N-ДНК должна концентрироваться ближе ко дну центрифужной пробирки, чем 14N-ДНК. Для того чтобы установить механизм репликации, авторы
выращивали штамм E.coli на «тяжелой» селективной среде в течение 14 поколений,
после чего пересаживали клетки на «легкую» среду и исследовали ДНК бактерий первого поколения. Плотность выделенной из этих клеток ДНК оказалась больше плотности ДНК клеток, выращенных в 14N-среде, но меньше плотности ДНК бактерий,
выращенных в 15N-среде. Это противоречило гипотезе о консервативном характере репликации ДНК, при котором ДНК разделились бы на две фракции с высокой и низкой
плотностью, но не с промежуточной (рис. 4, б). Таким образом, первая гипотеза была
отброшена.
Однако полученный результат не исключал дисперсный механизм репликации,
при котором участки материнской ДНК чередуются с участками дочерней. Для того
чтобы выяснить, какой из оставшихся механизмов верен, авторы проанализировали
плотность ДНК второго поколения бактерий, выращенного на «легкой» среде. По гипотезе дисперсной репликации плотность ДНК второго поколения должна быть одинаковой для всех молекул и занимать промежуточное положение между плотностью ДНК
клеток первого поколения и плотностью самой легкой ДНК. Оказалось, что клетки второго поколения содержали примерно равные количества легких и гибридных молекул
ДНК. Этот факт позволил исключить гипотезу дисперсного механизма репликации. Более того, при нагревании гибридные молекулы ДНК разделялись на две цепи: «легкую»
и «тяжелую» (см. рис. 4, б).
>>> 7
>>>
Оставался еще один вариант дисперсного механизма репликации, при котором новая
клетка получает по половине старой и новой молекулы ДНК. В 1963 г. Ральф выращивал бактерии в несколько раундов репликации на «тяжелой» среде, потом один раунд —
на «легкой», выделял ДНК и обрабатывал ее ультразвуком (рис. 5). После разделения фрагментов в градиенте хлорида цезия получилась только усредненная по массе полоса. Это
и стало последним доказательством полуконсервативности механизма репликации ДНК.
а
15
N
Дисперсный Полуконсервативный
14
N
Консервативный
0 01
100 %
Поколение
1
100 %
Плотность CsCl
>>> 8
б
Поколение
10 2 3 4
50 % 75 % 88 %
100 % 50 %
100 %
25 % 12 %
Плотность CsCl
Рис.4. Эксперимент Мезельсона иСталя как доказательство полуконсервативного
механизма репликации ДНК. Распределение легких итяжелых цепей
ДНК E.coli после центрифугирования бактериального лизата вградиенте CsCl
после одного (а) или нескольких раундов репликации (б)
сиспользованием обогащенных по14N культивационных сред
>>> Доказательства полуконсервативного механизма репликации ДНК и хромосом
100 %
E. coli,
14/15
N
ультразвуком
Рис.5. Эксперимент Ральфа. Распределение легких итяжелых цепей ДНК
E.coli после центрифугирования бактериального лизата, обработанного
ультразвуком, вградиенте CsCl после одного раунда репликации
сиспользованием обогащенных по14N культивационных сред
Кроме того, в конце 1950-х гг. полуконсервативный механизм репликации был показан на уровне хромосом эукариот. Джеймс
Герберт Тейлор в 1956–1957 гг. провел свои
эксперименты с клетками корешков боба
садового Vicia faba. Для маркировки ДНК
он подращивал клетки на радиоактивном
тимидине, содержащем тритиевый изотоп,
затем переводил эти клетки на нормальную среду (рис. 6). Добавление колхицина
приводило к ингибированию расхождения
хромосом, так что хромосомы в метафазе
не разделялись, а сестринские хроматиды
оставались «связанными» центромерой.
Обработка
3
H-тимидин
Плотность CsCl
50 %
50 %
Плотность CsCl
Хроматида
Рис.6. Эксперимент Тэйлора длядемонстрации
полуконсервативного механизма репликации
сиспользованием хромосом Vicia faba
>>> 9
>>>
После одного раунда репликации он собирал «метафазные» хромосомы и экспонировал их на рентгеновской пленке. После экспозиции можно было различить меченную
выделенную ДНК. Оказалось, что обе хроматиды первого поколения содержат радиоактивный изотоп. После второго раунда деления одна хроматида каждой хромосомы оказывалась меченой, а вторая оставалась нерадиоактивной. Эта радиограмма
наглядно продемонстрировала полуконсервативный механизм репликации хромосом.
ФЕРМЕНТАТИВНАЯ СИСТЕМА СИНТЕЗА ДНК IN VITRO. АКТИВИРОВАНИЕ ДНК
Это было мое убеждение… вы должны знать актеров,
чтобы понять сюжет. А актеры — ферменты.
Они являются мини-химиками, машинами, спомощью
которых протекают биологические явления…
легендарный ли это вопрос спиртового брожения…
или как светится светлячок.
А. Корнберг
Артур Корнберг — врач по образованию, американский биохимик, иностранный
член Лондонского королевского научного общества. Сначала занимался очисткой ферментов, потом поиском путей синтеза dNTP. К описываемому моменту он знал о существовании связи между АТР и энергией, пытался из тканей животных выделить фермент, отвечающий за синтез АТР. Учился у Северо Очоа, который в 1955 г. объявил
об открытии фермента, синтезирующего молекулу РНК (хотя, как это впоследствии
выяснилось, были только РНК-олигонуклеотиды). Корнберг сосредоточил все усилия
на изучении синтеза ДНК. В то время он преимущественно работал не с органами и тканями животных, а с дрожжами и бактериями. Чтобы найти необходимый фермент, он
добавил к экстракту разрушенных клеток E.coli АТР, а также соответствующие нуклеотиды, содержащие радиоактивные изотопы, позволяющие проследить их включение
в растущую цепь нуклеиновой кислоты, а затем добавил выделенную ДНК в качестве
праймера для новой цепи. Прошло много месяцев, прежде чем его старания увенчались успехом и он смог достичь достоверного уровня синтеза ДНК с радиоактивным
тимидином. Это было сделано в 1956 г. Корнберг наработал 90 кг биомассы E.coli и вы-
делил из клеточного экстракта 0,6 г бактериального фермента, синтезирующего ДНК,
который он назвал ДНК-полимеразой. В течение года Корнбергу удалось синтезировать
ДНК из различных источников при помощи этой полимеразы. Две статьи, описывающие эту работу, были представлены в JournalofBiologicalChemistry в октябре 1957 г.
Редакторы JBC, однако, отвергли статьи: некоторые возражали против самого названия
продукта «ДНК», предпочитая технически точный, но громоздкий термин «полидезоксирибонуклеотид», другие утверждали, что должна быть показана генетическая актив-
>>> 10