Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Биоконверсия растительного сырья. Учебное пособие
.pdf
Папаин (3.4.22.2) и химопапаины А и В (3.4.22.6) выделяют из млечного со-
ка дынного дерева. Это ферменты молекулярной массы 23,4-28 кДа с оптимумом
pH 6-7. Папаин стабилен в зоне pH 3-11, наибольшая стабильность при pH 5. В
присутствии окислителей папаин быстро теряет активность, поэтому при работе с
ферментом необходимо следить за окислительным потенциалом среды.
Бромелаин (3.4.22.4) выделяют из сока зрелых стеблей ананаса, фермент
имеет массу 35 кДа, оптимальный pH 5-6.
Фицин (3.4.22.3), получаемый из латекса тропического инжира, имеет моле-
кулярную массу 23,8 кДа и оптимальный pH 6,5-9,5.
Папаин, бромелаин, фицин - протеиназы широкой субстратной спе-
цифичности. Они гидролизуют в белках пептидные связи, образованные лейцином
или глицином. Другие типы связей, в том числе характерные для специфичности
пепсина, трипсина, химотрипсина, карбоксипептидазы, также могут расщепляться,
хотя и с меньшей скоростью. Благодаря этому растительные тиоловые протиназы
более глубоко гидролизуют белки, чем сериновые и карбоксильные протеиназы
животного происхождения.
Тиоловые протеиназы продуцируют различные микроорганизмы - клостри-
дии, стрептококки, стафилококки. Микробные тиоловые протеиназы наиболее ак-
тивны при pH 7-8,8.
Карбоксильные протеиназы распространены у животных и эукариотиче-
ских микроорганизмов. В активный центр карбоксильных протеиназ входят остат-
ки дикарбоновых аминокислот.
Карбоксильные, или кислые протеиназы, за малыми исключениями, прояв-
ляют активность в кислой среде. Ингибиторами активности являются диазокетоны,
для некоторых представителей группы - эпоксисоединения и микробный ингибитор пепстатин.
К числу кислых протеиназ относятся пепсины млекопитающих - пепсин А
(3.4.23.1), пепсин В (3.4.23.2) и пепсин С (3.4.23.3). Это белки массы 31-40 кДа с
оптимумом действия при pH 2-4.
41
В слизистой желудка человека синтезируется предшественник пепсина - песиноген (42 кДа), который превращается в пепсин (34-35 кДа) в присутствии кис-
лоты или автокаталитически, в результате гидролиза активным пепсином. Один из
пептидов, отщепляемых от пепсиногена, является ингибитором активного фермен-
та. Ингибитор имеет массу 3,2 кДа, он соединяется с пепсином при pH не ниже 5. В
комплексе с ингибитором пепсин стабилен. В кислой среде, при pH 2 происходит
самопереваривание фермента, это защищает слизистую оболочку желудка от раз-
рушения.
Пепсин проявляет специфичность в отношении связей, образованных ами-
ногруппами тирозина или фенилаланина. Наличие свободной аминогруппы вблизи
пептидной связи препятствует гидролизу, а карбоксильной увеличивает его ско-
рость. Пепсин расщепляет различные животные и растительные белки, в том числе
казеин, коллаген, глютин, эластин, кератин, гистон и др.
Способность синтезировать кислые протеиназы широко распространена у
микроскопических грибов - аспергиллов, пенициллов, мукоров, Rhizopus, Tricho-
derma и др. Эта группа ферментов проявляет активность при pH 2-4, молекулярная
масса большинства кислых протеиназ грибов лежит в пределах 32-39 кДа. Внекле-
точные кислые протеиназы грибов наряду с другими видами протеолитических
ферментов входят в состав комплексных препаратов из культур микромицетов, таких как амилоризин, пектаваморин, пектофоетидин, целловиридин, целлюлаза -
100 и др. Из аспергиллов выделяют очищенные препараты кислой протеиназы,
предназначенные для пищевой промышленности и медицины.
Металлосодержащие протеиназы - это ферменты, в активный центр кото-
рых входит ион или ионы металлов, существенные для проявления каталитической
активности. Такими металлами чаще всего являются цинк, кобальт или марганец.
Некоторые металлопротеазы содержат как единственный металл кальций или маг-
ний. Кальций может входить в молекулу фермента также как ион-стабилизатор.
Так в металлопротеазе В. subtilis цинк является каталитически активным металлом,
а кальций - стабилизатором.
42
Металлы играют важную роль в каталитическом акте. С их помощью обра-
зуется тройной координационный комплекс: фермент-металл-субстрат. При этом
стабилизируется высшее валентное состояние металла. Ионы металлов могут обра-
зовывать координационные связи с атомами азота, серы, кислорода - атомов с неподеленными парами электронов.
Отток электронов от групп > С = 0 и –NH- к иону металла облегчает разрыв
пептидной связи.
Все металлопротеазы ингибируются хелатными агентами (ЭДТА, о- фенан-
тролином и др.). Инактивация чаще всего носит обратимый характер. При введе-
нии в среду избыточного количества соответствующего иона металла или после
удаления хелата диализом, ультрафильтрацией, активность восстанавливается.
Металлопротеиназы широко распространены у бактерий, встречаются и у
микроскопических грибов. Бактериальные металлопротеазы - белки с молекулярной массой 28-48 кДа, проявляющие активность в нейтральной или слабощелочной
среде, при pH 6,5-9.
В. subtilis - продуцент протеолитического ферментного препарата протосуб-
тилина - выделяет в среду две металлопротеиназы - А и Б, с молекулярной массой
44 и 40 кДа. Первая имеет оптимум при pH 7, вторая - при pH 7,5 и 11,0. Основная
активность связана с протеиназой А, которая менее термостабильна, чем Б: за час
при 60 °С протеиназа А подавляется полностью, а Б - на 22 %. Смесь очищенных
протеиназ А и Б быстро инактивируется, при этом молекулярная масса каждого
фермента снижается вдвое. Полагают, что протеиназа Б разрушает А и автоката-
литически расщепляется. Интересно отметить, что неочищенные препараты проте-
иназ В. subtilis (протосубтилины ГЗХ и ГIОХ) не имеют тенденции к быстрой автокаталитической инактивации.
Нейтральная бактериальная протеиназа из В. subtilis 103 - белок с молекулярной массой 30,5-34 кДа, оптимум действия при pH 7-7,5 и температуре 50 °С.
Фермент стабилен при pH 7-8 и комнатной температуре. Расщепляет преимуще-
ственно петидные связи, образованные аминогруппами гидрофобных аминокислот
(фенилаланина, валина, норвалина). Не обладает ни амидазной, ни эстеразной ак-
43
тивностью. Гидролизует казеин, гемоглобин, желатину, яичный и сывороточный
альбумин, белки зерновых культур и клеточных стенок микроорганизмов.
Из культуры термофильного штамма В. brevis выделено три протеиназы,
одна из которых - нейтральная металлопротеиназа с молекулярной массой 37-40
кДа, оптимум действия при pH 6,5-7 и температуре 70 °С.
Из культуры термофильной бактерии В. thermoproteolyticus выделяют пре-
парат термолизин, содержащий нейтральную металлопротеиназу. Фермент содер-
жит ионы цинка и кальция, имеет молекулярную массу 37,5 кДа и оптимум при pH
8.
Из амилолитического ферментного препарата амилоризина ПIОХ выделена
металлопротеиназа гриба A. oryzae. Фермент представляет собой кислый белок с
изоэлектрической точкой при pH 4.5 и молекулярной массой 41 кДа. Оптимальный
pH 5,6. Фермент активируется ионами кобальта, полностью ингибируется хелата-
ми.
Аминопептидазы катализируют отщепление N - концевых аминокислот от
молекул пептидов и белков.
Большинство аминопептидаз относится К числу металлоферментов, или
проявления их активности необходимы ионы цинка, кобальта, марганца, магния,
кальция. В активном центре могут быть один или два вида металлов. Ионы метал-
лов могут быть прочно связаны в активном центре (каталитически активные ионы)
или выступать как активаторы, лабильно связывающиеся с ферментом. Хелаты и
тяжелые металлы подавляют активность металлосодержащих аминопептидаз.
Важной аминокислотой активного центра аминопептидаз является ирозин и,
возможно, гистидин. У некоторых аминопептидаз каталитически активной являет-
ся сульфгидрильная группа цистеина, на что указывает ингибирование солями рту-
ти и N-этилмалеинимидом.
Некоторые аминопептидазы относятся к числу сериновых.
Аминопептидазы выполняют важную роль в белковом обмене. Они входят в
комплекс внутриклеточных ферментов, присутствующих в рибосомальной и мем-
44
бранной фракциях. Внутриклеточные аминопептидазы - крупные белки с молекулярной массой до 400 кДа, большинство их проявляет активность при pH
Микроорганизмы, активно продуцирующие протеолитические ферменты,
синтезируют как внутриклеточные, так и внеклеточные аминопептидазы. Это ха-
рактерно для бактерий и актиномицетов. В состав препарата проназы из актино-
мицета Str. griseus K-I входят пять лейцинаминопептидаз. Два фермента с молекулярной массой 23 и 25 кДа, имеют оптимум при 7,5-10, стабильны в зоне pH 6-11.
Ингибируются ЭДТА. Стабилизатором активного состояния является кальций, в
присутствии которого ферменты стабильны при температуре до 70 °С.
Аминопептидазной активностью обладают препараты протелин (продуцент
- один из штаммов Str. griseus) и римопротелин (продуцент- Sir. fradiae).
Металлозависимые аминопептидазы обнаружены в комплексных протеолитических препаратах из В. subtilis - бактерии, широко используемой как про-
мышленный продуцент ферментов. Аминопептидаза этой бактерии, имеющая в
классификации ферментов номер 3.4.11.10, содержит цинк в качестве каталитиче-
ски активного металла и кобальт - как активатор. Молекулярная масса фермента
46,5 кДа.
Карбоксипептидазы катализируют отщепление аминокислот от С - концов
пептидов и белков.
Карбоксипептидазы широко представлены у растений, микроорганизмов и
животных, они играют важную роль в белковом обмене.
Среди карбоксипептидаз встречаются и металлоферменты. В подже-
лудочной железе синтезируются карбоксипептидазы А и В. Предшественники этих
ферментов активируются под действием трипсина. Карбоксипептидаза А - метал-
лофермент, содержит один атом цинка на молекулу. Как активаторы могут высту-
пать и другие дивалентные металлы. Молекулярная масса фермента 34,3 кДа, оп-
тимальный pH 7,5, зона стабильности - pH 6-10,2. Карбоксипептидаза В идентична
по массе и содержанию цинка, стабильна при pH 7-9. Оба фермента имеют как
пептидазную, так и эстеразную активность, соотношение которых можно регули-
ровать введением в среду различных дивалентных ионов.
45
Карбоксипептидазы есть у многих покрытосеменных (томата, арбуза, фасо-
ли, шпината и др.). В клетках растений присутствуют как связанные, так и раство-
римые формы карбоксипептидаз. Максимальную активность находят во фракции
митохондрий.
Все растительные карбоксипептидазы - кислые белки с изоэлектрической
точкой при pH 4,3-5,4. Молекулярная масса 90-175 кДа. Оптимальный pH 5-5,6,
стабильны в зоне pH 4-6. Оптимальная температура 40-50 °С.
Большинство растительных карбоксипептидаз относятся к сериновым фер-
ментам. Из их числа - уникальная карбоксипептидаза фасоли, способная отщеплять
с С-концов белков все аминокислоты, за исключением аспарагиновой. Предпочтительно наличие на С-конце аминокислоты с длинной алифатической цепью, а по
соседству с ней - ароматической аминокислоты.
Карбоксипептидаза из кожуры апельсина является металлоферментом, со-
держащим 3,6 атома цинка на молекулу. Фермент отщепляет с С- конца белков
ароматические, кислые аминокислоты и пролин. Приведенные примеры свидетель-
ствуют о широкой субстратной специфичности растительных карбоксипептидаз.
Из культур микроорганизмов выделено около 40 различных карбо-
ксипептидаз, шесть из которых включены в номенклатуру ферментов. Карбокси-
пептидазы входят в состав комплекса внутриклеточных протеолитических фермен-
тов микроорганизмов, они локализуются в мембранах, у дрожжей - также в вакуо-
лях. Многие микроорганизмы продуцируют как внутриклеточные, так и внекле-
точные карбоксипептидазы. Это свойственно микрокоскопическим грибам (пени-
циллам, аспергиллам, мукорам и др.), а также актиномицетам. Микроорганизмы
могут синтезировать по нескольку карбоксипептидаз. Из культуры A. oryzae выделено четыре разновидности фермента.
Карбоксипептидазы - белки молекулярной массы от 30 до 160 кДа. Оптимальный pH для грибных карбоксипептидаз 3-5,3, для бактериальных 8-9,8. Оптимальная температура действия карбоксипептидаз А. oryzae 40-50 °С, В. stearother-
mophilus 55 °С. Ферменты аспергилла стабильны при температуре до 50 °С.
Карбоксипептидазы могут иметь различную структуру активного центра.
Карбоксипептидазы некоторых грибов и актиномицетов являются металлофермен-
46
тами, для проявления активности которых необходимы ионы цинка, марганца,
магния, кальция. Цинк и кальций присутствуют в активном центре карбоксипепти-
дазы стрептомицета (препарат проназа), цинк найден в составе карбоксипептидаз
Corynebact. equi, Pseudomonas. Известны микробные карбоксипептидазы, не со-
держащие прочно связанных металлов, но активирующиеся в присутствии ионов
металлов.
Карбоксипептидаза пекарских дрожжей с оптимумом при pH 4-6 принадлежит к группе сериновых, так же как нейтральная Д-аланинкарбоксипептидаза
некоторых стрептомицетов и бацилл. Нейтральная Д- аланинкарбоксипептидаза
кишечной палочки - тиоловый фермент.
Металлосодержащие карбоксипептидазы ингибируются хелатами, кислые
карбоксипепгидазы грибов - детергентами.
Карбоксипептидазы микроорганизмов гидролизуют субстраты, имеющие на
С-конце свободную α-карбоксильную группу, на N-конце предпочтительно наличие защитных радикалов - карбобензокси - или гиппурила.
Из шести классифицированных микробных карбоксипептидаз три имеют
абсолютную субстратную специфичность. Это глутамат-, аспартат- и аланинкарбоксипептидазы, которые расщепляют только те субстраты, которые имеют на С-
конце соответственно остаток глутаминовой кислоты (или глутамина), аспарагино-
вой кислоты (или аспарагина) и аланина.
Для карбоксипептидаз микроскопических грибов аспергиллов и пенициллов
характерна широкая субстратная специфичность. Ферменты пенициллов отщепля-
ют от пептидов остатки пролина, лизина, аргинина, глицина, глутаминовой и аспа-
рагиновой кислот. Кислая карбоксипептидаза A. saitoi последовательно отщепляет
все аминокислоты от нативного инсулина и некоторых других пептидов. Гидролиз
ускоряет присутствие на С-конце пептида предпоследней ароматической аминокислоты.
47
1.2.3 Липиды
Культура
Маслосодержащая часть
Содержание липидов, %
Кокосовая пальма
Копра
65-72
Масличная пальма
Мякоть ллода
46-67
Кунжут
Семена
52-65
Орех грецкий
Ядро
55-63
Арахис
Ядро
54-61
Миндаль
Ядро
40-64
Мак
Семена
40-57
Подсолнечник
Семянка
33-57
Рапс
Семена
38-45
Персик
.Ядро косточки
35-46
Кукуруза
Зародыши
30-48
Лен
Семена
27-47
Маслина
Мякоть плода
23-49
Соя
Семена
14-25
Пшеница
Зародыши
10-17
К группе липидов относят компоненты клетки, экстрагируемые орга-
ническими растворителями малой полярности и практически нерастворимые в во-
де. Различают стуктурные и запасные липиды. Структурные липиды входят в со-
став биомембран. Запасные липиды локализуются в виде скоплений и являются
энергетическим резервом клетки. Технологическое значение имеют запасные ли-
пиды растений, которые выделяют в виде растительных масел.
Запасные липиды локализуются в семенах, ядрах и мякоти плодов растений.
В богатых липидами клетках обнаружены липидные сферосомы, заполняющие
значительную часть объема клетки. Относительное содержание липидов в маслич-
ном сырье может быть очень высоким - до 72 % (таблица 4). Объектами переработки служат и относительно бедные маслом виды сырья, если извлекаемые масла бо-
гаты биологически активными соединениями. Примером служат зародыши злаков.
Масло из зародышей пшеницы и кукурузы богато токоферолами.
Таблица 4 - Содержание липидов в различных видах масличного сырья
Запасные липиды растений представлены триацилглицеролами, которые со-
ставляют 95-97 % растительных масел. Запасные липиды высокомасличных видов
48
сырья хорошо извлекаются органическими растворителями и относятся к группе
свободных липидов. В ходе технологических процессов переработки масличного
сырья часть липидов может переходить из свободного в связанное и прочносвязан-
ное состояние. Это осложняет выделение масел, и тем более, чем ниже исходная
масличность сырья.
Биологическая ценность растительных масел зависит от их жирнокислотного со-
става и содержания жирорастворимых витаминов. Наиболее ценными компонента-
ми являются полиненасыщенные жирные кислоты и группа токоферолов (витамин
Е). Качество масел снижают такие липидные соединения, как хлорофилл, госсипол,
ароматические углеводороды. Жирнокислотный состав некоторых видов масел дан
в таблице 5. В маслах, выделенных из растений севера и средней полосы, преобла-
дают ненасыщенные жирные кислоты, содержание которых достигает в льняном
масле 91,5, подсолнечном и рапсовом - 89,8, пшеничном и кукурузном – 86-88 %. В
пальмовом масле ненасыщенных жирных кислот лишь около половины, в кокосо-
вом - не более 12 %. Масла с высоким содержанием насыщенных жирных кислот
(кокосовое, пальмовое, пальмоядровое) при комнатной температуре твердые, в отличие от масел с преобладанием ненасыщенных жирных кислот.
При природном синтезе триацилглицеролов из глицерола и жирных кислот
число возникающих разновидностей соединений меньше теоретического, которое
может быть очень велико (при наличии 10 различных жирных кислот, с учетом
стереонзомеров, может синтезироваться 650 различных триацилглицеролов). Био-
синтез происходит не по статистическим закономерностям, а избирательно. Нена-
сыщенные жирные кислоты преимущественно присоединяются в положении С2
глицерола, насыщенные - в положениях С1 и С3. Так в масле подсолнечника
насыщенные жирные кислоты С
16:0
и C
(пальмитиновая и стеариновая) обнару-
18:0
жены только в положении C1 и С3, а в положении С2 присоединены ненасыщен-
ные кислоты С
18:1
и С
(олеиновая и линолевая). Масла, в которых преобладает
18:2
один вид жирной кислоты, содержат значительные количества однокислотных три-
ацилглицеролов, то есть таких, в которых все три положения глицерола замещены
49
Таблица 5 - Жирнокислотный состав растительных масел, в % к сумме жирных кислот
Жирная
кислота
Вид масличного сырья
Подсолнечник
сорта Маяк
Лен сорта
Авангард
Рапс безэ-
руковый
сорта Кано-
ла
Копра ко-
коса
Масличная
пальма
Зародыши
пшеницы
Зародыши
кукурузы
Горчица са-
рептская
сорта Старт
С
6:0
- - -
0,2-2,0
- - -
-
С
8:0
- - -
6,0-9,7
- - -
-
С
10:0
- - -
4,5-10,7
- - -
-
С
12:0
- - -
44-52 - - - -
С
14:0
- - -
13-19
1-5
0,2
0,1-1,7
-
С
16:0
6,24
4,30
4,5
7,5-10,5
32-47
7-18
8-11
1,2
С
18:0
3,27
4,25
5,5
1,0-3,0
2-1
1-6
2,5-4,5
1,0
С
20:0
0,72
-
-
СЛЕДЫ
-
0,7
0,4
-
С
22:0
- - - - -
0,2
0,2
0,2
С
16:1
- - -
0-1,3
-
1,0
0,2-1,6
-
С
18:1
20,34
21,75
53,5
5,0-8,0
39-51
8-30
30-49
29,5
С
20:1
- - - - - - -
10,4
С
22:1
-
-
СЛЕДЫ
- - - - 18,1
С
18:2
69,43
12,20
25,5
1,5-2,8
5-11
44-65
40-56
26,9
С
18:3
-
57,50
10,8
- - 4-10
-
13,4
50
50
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]