Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

Биоконверсия растительного сырья. Учебное пособие

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

06.09.2026

Размер:

2 Мб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 12 / 132 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 > Следующая >>>

Клеточные стенки растений выполняют формообразовательную функцию,

регулируют водообмен и поступление питательных веществ в клетку, защищают протопласт от неблагоприятных внешних воздействий.

Растения имеют первичную и вторичную клеточную стенку. При делении

клеток первоначально возникает протопектиновая срединная пластинка, которая

служит основой первичной стенки. Сформировавшаяся первичная стенка состоит на 90 % из полисахаридов и на 10 % - из белков-гликопротеидов. Содержание целлюлозы в первичной стенке активно растущих тканей составляет от 20 % до 30 %. По мере старения клетки на внутренней стороне первичной стенки путем суперпозиции (наложения) образуется вторичная стенка.

Первичная стенка имеет сходное строение у клеток различных расти-

тельных тканей. Ригидную основу первичной стенки составляют микрофибриллы

целлюлозы, в которых молекулы удерживаются водородными связями. Каждая

микрофибрилла целлюлозы покрыта мономолекулярным слоем ксилоглюкана. Ли-

нейная (глюкановая) часть этого полимера имеет строение, идентичное целлюлозе,

благодаря чему возникает прочное взаимодействие с целлюлозой путем образования водородных связей. Боковые цепи ксилоглюкана направлены вовне и ориентированы перпендикулярно микрофибриллам целлюлозы. Связь ксилоглюкана с пек-

тином (рамногалактуронаном) осуществляется через молекулы арабиногалактана,

которые ковалентно присоединены одним кондом к боковой цепи ксилоглюкана, а

другим - к рамнозильному остатку рамногалактуронана. Каждая молекула рамно-

галактуронана имеет несколько рамнозильных остатков, за счет которых связыва-

ется с различными молекулами арабиногалактана и ксилоглюкана. При этом с од-

ной молекулой рамногалактуронана связываются молекулы ксилоглюкана, фикси-

рованные на различных микрофибриллах целлюлозы. Таким образом рамногалак-

туронан выполняет роль цементирующего компонента стенки. Как наиболее гиб-

кий из структурных полимеров стенки он обеспечивает ее эластичность.

Помимо ксилоглюкана, другие разновидности гемицеллюлозы (ксиланы,

глюкоманнаны, глюкогалактоманнаны и др.) имеют структуры, способные агреги-

роваться с целлюлозой за счет водородных связей. В растительной клеточной стен-

ке гемицеллюлозы выполняют роль полимера, осуществляющего связь целлюлозы

с пектином. В триаде целлюлоза-гемицеллюлоза-пектин жесткость структуры по-

лимеров убывает слева направо, а прочность их взаимосвязи возрастает в том же

направлении.

Во вторичной стенке растительных клеток содержание целлюлозы состав-

ляет не менее 60 %. Стенка представлена мультиплетными слоями, в каждом из ко-

торых микрофибриллы целлюлозы идут в направлении, перпендикулярном их

направлению в предыдущем слое, что создает жесткую конструкцию. Целлюлозная

арматура вторичной стенки погружена в лигноуглеводную матрицу, состоящую из

взаимопроникающих сеток полисахаридов и лигнина. Лигнин ковалентно связан с

гемицеллюлозой. Связь матрицы с целлюлозой осуществляется через молекулы

гемицеллюлозы, образующие, как и в первичной стенке, переходный слой на по-

верхности целлюлозных микрофибрилл.

В сильно одревесневших тканях содержание лигнина может составлять

30 %, или около половины по отношению к целлюлозе. Лигнин гидрофобен, и его

наличие осложняет переработку растительного материала, препятствуя смачива-

нию, необходимому для гидролиза. Задача ферментативной переработки сильно

лигнифицированного материала, например, соломы злаков, в настоящее время

полностью не решена.

Рассмотрим строение и механизм ферментативного гидролиза отдельных

структурных полисахаридов растительных клеточных стенок.

Целлюлоза - главный природный полимер, в растительном мире около поло-

вины углерода входит в состав целлюлозы. Ежегодно за счет фотосинтеза образу-

ется до 100 млрд, тонн целлюлозы.

Целлюлоза входит в состав всех органов и тканей растений, а также клеточ-

ных стенок некоторых видов грибов. Содержание целлюлозы составляет: в хлопковом волокне от 90 % до 98 %, стеблях льна от 80 % до 90 %, древесине различных пород дерева от 40 % до 50 %, листьях деревьев от 10 % до 15 %, травах, ботве сельскохозяйственных культур от 20 % до 40 %, лузге подсолнечника 40 %, зерне пшеницы 3 %, кукурузы и ржи 2,2 %; ячменя с оболочками - до 8 %, риса с оболочками – 9 %, без оболочек - 1,2 %; в зернах гороха и сои около 4 %.

Целлюлоза - регулярный линейный полимер глюкозы, остатки которой свя-

заны β-1,4-глюкозидной связью. Степень полимеризации колеблется от 500 до

12000 глюкозных единиц и составляет в хлопковом волокне 1200, листьях деревьев

от 1600 до 2100, листьях и стеблях трав от 550 до 1500, отрубях пшеницы и ржи

около 1000. Степень полимеризации целлюлозы в жилках листьев выше, чем в пла-

стинках; в стеблях выше, чем в листьях; в периферийных частях древесины выше,

чем в ядре.

Индивидуальные образцы целлюлозы представляют набор гомологов раз-

личной молекулярной массы, среди которых обычно выделяются одна или две пре-

обладающих фракции. Целлюлоза, выделенная из вторичных стенок растительных

клеток, более однородна по молекулярной массе, чем целлюлоза первичных сте-

нок.

Молекулы целлюлозы имеют плоскую зигзагообразную форму. Кольца

глюкозы лежат в одной плоскости, их вращению вокруг гликозидной связи препят-

ствуют водородные связи между гидроксильной группой при С3 и кислородным

атомом пиранозного кольца. Соседние цепи молекул целлюлозы соединены водо-

родными связями. Чередующиеся остатки глюкозы повернуты на 180° относитель-

но соседних компонентов цепи, благодаря чему существуют две стехиометрически

различные конформации целлобиозы (А и Б). Каждая из цепей стабилизирована

внутримолекулярными водородными связями.

В растительных тканях, молекулы целлюлозы образуют мицеллы. Цен-

тральная часть мицелл имеет размер 3x5 нм и состоит примерно из 50 плотно упа-

кованных молекул целлюлозы. Благодаря наличию водородных связей молекулы

образуют кристаллическую структуру. Внешняя часть мицеллы (кортекс) состоит

из молекул целлюлозы и гемицеллюлозы, их число около 100. Структура кортекса

менее жесткая, паракристаллическая Общий размер мицеллы 4,5х8,5 нм.

Степень кристалличности целлюлозы зависит от источника выделения и со-

ставляет в хлопковом волокне 0,73, древесине 0,6, у водорослей 0,43-0,50. В листьях и стеблях трав степень кристалличности целлюлозы 0,54-0,63, причем в жилках

листьев этот показатель выше, чем в пластинках: у шелковицы соответственно 0,606 и 0,555, у березы 0,630 и 0,558, у тополя 0,610 и 0,540.

Целлюлоза является одним из наиболее трудно гидролизуемых природных

полимеров. В организме высших животных и человека не синтезируются фермен-

ты, гидролизующие целлюлозу. Биодеградацию целлюлозы осуществляют фермен-

ты микроорганизмов. Микрофлора толстого кишечника человека ферментирует

целлюлозу овощей и фруктов полностью, более грубая целлюлоза, например, вхо-

дящая в препараты пищевых волокон, расщепляется на 70 %.

В гидролизе целлюлозы участвуют три вида ферментов. Эндо-1,4-β- глю-

каназы (3.2.1.4) катализируют неупорядоченное расщепление целлюлозных моле-

кул на крупные фрагменты. При действии экзо-1,4-β- глюканазы (целлобиогидро-

лазы, 3.2.1.91) от нередуцирующего конца целлюлозных молекул или их фрагмен-

тов отщепляется целлобиоза. Целлобиазы (β-глюкозидазы, 3.2.1.21) катализируют гидролиз целлобиозы с образованием глюкозы.

Индивидуальные эндо- и экзо-глюканазы способны расщеплять нативную

целлюлозу, однако в природе этот процесс происходит обычно под действием ком-

плекса ферментов.

Целлюлазные комплексы микроскопических грибов включают от 2 до 15-20

ферментов, среди которых, как правило, есть и эндо-, и экзо-глюканазы. Целлюла-

зы микроскопических грибов являются секретируемыми ферментами, гидролизу-

ющими целлюлозу вне клетки. Внутри клетки находят лишь целлобиазу. Ее суб-

страт может свободно поступать из внешней среды и расщепляться в клетке, что

повышает экономичность его использования.

У бактерий обычно находят целлюлазы только эндо-типа. У С1. thermocel-

lum наряду с эндо-глюканазами обнаружена целлобиогидролаза.

Бактериальные целлюлазы, так же как и целлюлазы грибов, являются секре-

тируемыми ферментами, однако функционируют преимущественно не в виде от-

дельных молекул, а в виде сложно организованных ассоциаций - целлюлосом и полицеллюлосом.

На поверхности бактериальных клеток, активно синтезирующих целлюлазы,

обнаруживают протуберанцы - полицеллюлосомы. Их структура изучена на примере C1. thermocellum. Полицеллюлосомы имеют размер в поперечнике 130-290 нм, высоту 60-100 нм. Они состоят из более мелких образований - целлюлосом,

размером около 18 нм, в состав которых входит не менее 14 белковых субъединиц.

Целлюлазные ансамбли лабильны. За час при температуре 59 °С и pH 6,8 целлюлолитические ферменты Cl. thermocellum полностью переходят в раствор. В процессе деструкции целлюлосомы некоторое время сохраняют кластерную структуру.

Лабильность целлюлосом важна в процессе гидролиза целлюлозы. При кон-

такте с целлюлозной мицеллой происходит реорганизация полицеллюлосом, так

что они образуют волокнистую объемную сеть, заполняющую пространство между

стенкой бактериальной клетки и целлюлозной мицеллой. Сродство целлюлаз к

субстрату обеспечивает адгезию клеток на поверхности целлюлозы в процессе ее

гидролиза. Продукты гидролиза диффундируют в клетку по коридорам целлюлаз-

ной сети. Очевидно, что гидролиз целлюлозы с помощью ферментных комплексов,

ассоциированных в целлюлосомы, происходит иначе, чем растворенными фермен-

тами. Растворенные ферменты, как правило, менее активны, чем ассоциированные.

Гидролиз целлюлозы ассоциированными бактериальными целлюлазами

имеет место в рубце жвачных животных. В рубцовой жидкости лишь около 5 %

целлюлаз находятся в свободном состоянии, остальная часть представлена ассоци-

атами. В гидролизе целлюлозы участвуют различные бактерии, населяющие рубец.

За 6-8 часов пребывания в этом отделе желудка целлюлоза расщепляется на 40-50

Полнота гидролиза целлюлозы зависит от ряда факторов, в числе которых

следующие: степень кристалличности субстрата, величина его удельной поверхно-

сти, состав ферментативного комплекса, используемого для гидролиза, и свойства

его компонентов.

Нативная целлюлоза имеет очень прочную структуру и трудно гидролизуется. Легко поддается действию ферментов лишь наиболее рыхлая, периферийная часть целлюлозных мицелл, составляющая 5-7 %. При исследовании гидро-

лиза образцов целлюлозы различной степени кристалличности найдена обратная

зависимость скорости гидролиза от процента кристалличности.

Для увеличения доступности целлюлозы действию ферментов ее подверга-

ют измельчению. При этом снижается размер частиц, увеличивается удельная по-

верхность субстрата и доля аморфной части. При сильном механическом воздей-

ствии может быть даже снижена степень полимеризации целлюлозы. Скорость

гидролиза целлюлозы прямо пропорциональна величине удельной поверхности,

она увеличивается по мере снижения размера частиц и степени полимеризации

целлюлозы.

Микроорганизмы синтезируют целлюлазные комплексы, различающиеся по

способности гидролизовать целлюлозу с высокой степенью кристалличности. Так

называемые «неполноценные» комплексы хорошо гидролизуют аморфную целлюлозу, а в кристаллической целлюлозе расщепляют ее аморфную фракцию (2-5 %). Резкое снижение активности «неполноценных» комплексов по отношению к «полноценным» наблюдается при возрастании степени кристалличности субстрата до

60-70 %.

Полноценные целлюлазные комплексы обязательно содержат эндоглюканазы, способные прочно сорбироваться на субстрате. Эндо-глюканазы, гидролизующие нативную целлюлозу на 88-97 %, такие как из Trichoderma reesei, Т. viride, Т. longibrachiatum, Geotrichum candidum, имеют коэффицент распределения

между поверхностью целлюлозы и раствором от 0,09 до 0,15 л/г, тогда как фермен-

ты, гидролизующие субстратна 8-27 % - соответственно 0,015-0,025 л/г. Чем выше

коэффицент распределения, тем выше реальная концентрация фермента на поверх-

ности субстрата и скорость его расщепления. Наблюдается прямая пропорциональ-

ная зависимость скорости гидролиза кристаллического субстрата от количества эн-

до-глюканазы, сорбированной на его поверхности. В то же время скорость гидролиза растворимого производного целлюлозы - карбоксиметилцеллюлозы - зависит

лишь от количества фермента в реакционной среде, но не от его сорбционной спо-

собности. Это объясняется тем, что в истинном растворе субстрата кинетика гид-

ролиза подчиняется закону действия масс: скорость реакции пропорциональна числу случайных столкновений фермента и субстрата.

Ферменты с высокой способностью сорбироваться на субстрате участвуют

не только в гидролизе кристаллической целлюлозы, но и в процессе ее диспергиро-

вания. После исчерпания легкодоступной аморфной части субстрата дальнейший

гидролиз возможен только после расчленения целлюлозных мицелл. На участках с

дефектами структуры происходит сорбция и концентрирование ферментных моле-

кул, которые оказывают давление на стенки капилляров, пор и микротрещин цел-

люлозных мицелл, увеличивая расстояния между молекулами. В образовавшиеся

пространства проникает вода, что приводит к разрыву водородных связей между

молекулами целлюлозы, их сольватации и расслаиванию. На аморфизированные

участки сорбируются молекулы фермента, тем самым закрепляя дефекты кристал-

лической структуры и предотвращения слипание молекул целлюлозы.

В процессе диспергирования целлюлозы могут участвовать как эндоглюканазы, так и целлобиогидролазы. В полноценном целлюлазном комплексе, где, как правило, присутствует эндо-фермент с высокой сорбционной способно-

стью, целлобиогидролаза может и не обладать этим свойством. При этом наблюда-

ется синергизм действия целлобиогидролазы и эндо-глюканазы: активность ком-

лекса ферментов выше суммы активности его составляющих. Синергизм объясня-

ется тем, что эндофермент путем механохимического воздействия подготавливает

субстрат для экзо-фермента, а также последовательностью реакций расщепления целлюлозы, катализируемых эндо- и экзо-глюканазами.

Синергизм действия может наблюдаться в различных комбинациях эндо- и экзо-ферментов (эндо-эндо, экзо-экзо, эндо-экзо), но в любом случае одна из цел-

люлаз значительно отличается от другой по способности адсорбироваться на суб-

страте. Ферменты, близкие по сорбционной способности, при соединении не про-

являют синергизма. Синергический эффект целлюлаз значителен: степень расщеп-

ления субстрата увеличивается в 2,5-2,8 раза. Так степень расщепления целлюлозы слабоадсорбирующейся эндо-глюканазой Т. viride составляет 30-40 %, а смесью ее с прочноадсорбирующейся эндо-глюканазой того же гриба - более 75 %.

Большинство полноценных целлюлазных комплексов содержат сильносор-

бирующуюся эндо-глюканазу в сочетании с целлобиогидролазой, усиливающей действие эндо-фермента за счет синергизма. Вместе с тем глубокий гидролиз кри-

сталлической целлюлозы могут осуществлять не только комплексы, но и индиви-

дуальные эндо-глюканазы, хорошо сорбирующиеся на субстрате и имеющие достаточно высокую осахаривающую способность, то есть эндо-глюканазы со смещением свойств в направлении экзо-действия. Такие эндо-глюканазы при расщеп-

лении целлюлозы образуют наряду с целлодекстринами значительное количество

глюкозы. При этом чем выше осахаривающая способность эндо-гклюканазы, тем

более выражена ее способность расщеплять кристаллитическую целлюлозу. Обра-

зование глюкозы идет по механизму трансгликозилирования, то есть в результате

отщепления ее от продукта конденсации фрагментов целлюлозы, образовавшихся

при гидролизе. Полагают, что некоторые эндо-целлюлазы способны расщеплять целлобиозу по механизму трансгликозилирования.

Индивидулаьные целлобиогидролазы, так же как и эндо-глюканазы, могут

осуществлять глубокий гидролиз кристаллической целлюлозы, если прочно сорби-

руются на субстрате. Скорость гидролиза целлюлозы целлобиогидролазой лимити-

руется накоплением продукта реакции - целлобиозы, являющейся сильным ингибитором фермента. Константа ингибирования составляет 6-10-6 М или 0,0021 г/л.

Это означает, что при данной концентрации целлобиозы активность целлобиогид-

ролазы снижается вдвое, если фермент находится в растворе и не связан на по-

верхности целлюлозы.

При гидролизе целлюлозы ферментными комплексами, включающими цел-

лобиазу, ингибирование целлобиозой снимается за счет ее расщепления. Образу-

ющаяся глюкоза также является ингибитором процесса, хотя в меньшей мере. Ин-

гибирование продуктами реакции не позволяет достичь высокой концентрации

глюкозы в промышленных процессах ферментативного гидролиза целлюлозы, если

не предусмотрено выведение глюкозы из сферы реакции.

Для гидролиза целлюлозы используется комплексные ферментные препара-

ты, выделяемые из культур микроскопических грибов и актиномицетов, обладаю-

щие эндо-глюканазной, целлобиогидролазной и целлобиазной активностью. Большинство целлюлаз грибов и актиномицетов имеют оптимум при pH 4-5,5 и температуре 40-60°. Некоторые высшие базидиомицегы синтезируют целлюлазы с опти-

мумом при pH 3. Многие целлюлазы являются углеводосодержащими белками, уг-

леводная часть может составлять до 90 % молекулярной массы. Считают, что по-

мимо защиты белка от денатурирующих агентов и протеолиза, углеводная часть

выполняет якорную функцию, способствуя сорбции фермента на субстрате. Сорб-

ция по сродству необходима, поскольку в pH-зоне активности целлюлазы имеют незначительный заряд (рН-оптимумы близки к изо-электрическим точкам). Воз-

можно, углеводная часть обеспечивает скольжение фермента в фибриллярных

структурах целлюлозы. Это существенно, поскольку целлюлазы осуществляют

сотни и тысячи каталитических актов, не покидая поверхности одной целлюлозной

молекулы.

Конверсия целлюлозы в природных биоценозах сопряжена с деструкцией

лигнина. Комплекс ферментов, разрушающих оба полимера, образуют высшие ба-

зидомицеты, вызывающие белую гниль древесины. В деструкции лигнина участ-

вуют оксидоредуктазы, гидролазы (в частности, эстеразы) и трансферазы. Окисли-

тельная деструкция лигнина идет при участии перекиси водорода, образующейся

при окислении простых углеводов, например, глюкозы, с помощью глюкозоокси-

дазы или целлобиозы под действием целлобиозооксидазы. Таким образом, продук-

ты гидролиза целлюлозы участвуют в превращении лигнина.

Гемицеллюлозы - большая группа щелочерастворимых полисахаридов рас-

тений. В состав гемицеллюлоз входят глюкоза, галактоза, манноза, ксилоза, араби-

ноза, фукоза. Некоторые гемицеллюлозы содержат остатки уроновых кислот. Сре-

ди гемицеллюлоз встречаются как гомополимеры (глюкан, галактан), так и гетеро-

полимеры (арабаноксилан, кси-логлюкан, фукогалактоманнан и др.). Большинство

гемицеллюлоз имеют нерегулярное строение, содержат разветвленные участки.

Эти особенности структуры объясняют более высокую растворимость гемицеллю-

лоз по сравнению с целлюлозой. Растворимость гемицеллюлоз в воде возрастает с

увеличением степени ветвления и снижением молекулярной массы.

Гемицеллюлозы находят во всех органах и тканях растений. Содержание

гемицеллюлоз составлаег от 5 % до 48 % сухой массы растений. В биомассе травянистых растений находят 16-25 %, листьях древесных пород 12-15 %, древесине

22-40 %, пшеничных отрубях 26 %, жоме сахарной свеклы – 37 %, зерне пшеницы 8-14 %.

К числу наиболее распространенных видов гемицеллюлозы высших расте-

ний относятся ксилоглюканы, ксиланы, глюканы, галактаны, маннаны.

Ксилоглюканы составляют около 20 % массы клеточных стенок двудольных растений и около 2 % стенок однодольных.

Ксилоглюканы относятся к разветвленным полимерам. Их линейная часть

состоит из β-1,4-связанных остатков глюкозы, то есть имеет строение, идентичное

целлюлозе. Боковые цепочки присоединены к глюкозным остаткам основной цени

в положении 0-6 через первый углеродный атом остатка ксилозы (связь α-1,6). Боковые цепочки могут быть представлены единственным остатком ксилозы или

двумя и более остатками сахаров. Остатки галактозы, арабинозы, фукозы, ксилозы

в боковых цепях соединены между собой связями 1-2. Растительные ксилоглюканы

различаются по степени замещения (ветвления), составу и длине боковых цепочек.

Ксилоглюканы двудольных растений имеют более высокую степень ветвления, чем

у однодольных. Первые могут быть переведены из щелочных экстрактов в водные

растворы, вторые растворяются только в щелочах.

В состав ксилоглюкана ячменя входят глюкоза, ксилоза, арабиноза и галак-

тоза в соотношении 62:29:4:5, в ксилоглюкане риса те же сахара в соотношении

64:27:6:4.

Образцы ксилоглюканов, выделенных из одного источника, представляют

собой смесь полимеров, различающихся по величине молекулярной массы и степе-

ни ветвления. Молекулы с низкой степенью ветвления, имеющие достаточно про-

тяженные участки незамещенного β-1,4-глюкана, ассоциируются с целлюлозными

молекулами с помощью водородных связей. К ассоциированным молекулам кси-

логлюкана ковалентной связью присоединяются молекулы других полисахаридов,

составляющих структурную основу клеточной стенки растений. Сильно разветв-

ленные молекулы ксилоглюкана не ассоциируются с целлюлозой и могут нахо-

диться в свободном состоянии. В процессе развития растения и индивидуальной

растительной клетки изменяется фракционный состав ксилоглюкана, прочность

связи с другими полисахаридами. Эти изменения происходят при участии гидроли-

тических ферментов растений.

При ферментативном гидролизе ксилоглюкана лимитирующей стадией ре-

акции является отщепление боковых цепочек от глюкановой цепи. Гидролиз α-1,6-

связи, соединяющей ксилозные остатки с глюканом, катализирует фермент ксило-

зидаза. После полного отщепления боковых цепочек ксилоглюкан превращается в

<<< < Предыдущая 12 / 132 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 > Следующая >>>

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]