Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Биоконверсия растительного сырья. Учебное пособие
.pdf
крыты простыми мембранами. Типичные белковые тельца из семян конского боба
состоят из билипидного слоя толщиной 1 мкм, с которым связано около 30 различ-
ных белков.
Матрица белковых телец имеет аморфную структуру. В матрице локализу-
ются запасные белки, гидролитические ферменты (протеазы, амилазы, липазы,
гликозидазы, фосфатазы), а также гликопротеины пектинового ряда, способству-
ющие сохранению структурной прочности белковых телец. Гидролитические фер-
менты в процессе прорастания семян расщепляют запасные вещества. Наличие
гидролитического аппарата в белковых тельцах позволило некоторым исследова-
телям рассматривать их как аутофагические органеллы, родственные лизосомам.
Глобоиды состоят из фитина. Кристаллоиды имеют белковую природу. У растений
семейства зонтичных в белковых тельцах, помимо глобоидов и кристаллоидов, обнаружены друзы оксалата кальция.
Семена злаков имеют простые белковые тельца без включений. В эндо-
сперме зрелых зерновок ржи и ячменя нет четко индивидуализированных белко-
вых телец, скопления белка имеют неправильную форму, они окружают крахмаль-
ные гранулы. В зернах пшеницы встречаются скопления белка, образовавшиеся за
счет слияния белковых телец в процессе формирования семени.
У бобовых и масличных культур белковые тельца сложные, с одним или
двумя видами включений. У сои и арахиса найдены как сложные, так и простые
белковые тельца.
В подземных запасающих органах растений белок содержится в клеточном
соке и органеллах. Доля белка, локализованного в тельцах, у покоящихся клубней
и корнеплодов выше, чем у активно растущих.
Белок зеленых листьев, выделяемый в виде клеточного сока при прессова-
нии биомассы, содержит растворимые белки листьев и фрагменты хлоропластов.
Хлоропластные белки составляют до 75 % листового белка. Белку сопутствуют
пигменты - хлорофиллы и каротиноиды.
По признаку растворимости белки делят на четыре группы: альбумины рас-
творяются в воде, глобулины - в 5-10 % растворах поваренной соли, проламины - в
60-80 % этаноле, глютелины - в 0,1-0,2 % щелочи. Первые две группы объединяют
31
под названием растворимые белки. Это наиболее легко гидролизуемые и усвояе-
мые белки. Они гидрофильны, в отличие от проламинов и глютелинов. Фракция
растворимых белков включает биологически активные белки - ферменты, ингибиторы ферментов, лектины.
У зерновых (пшеницы, ячменя, овса, кукурузы) преобладают проламины и
глютелины, у ржи - альбумины и проламины, у риса 80 % белка представлено глютелинами.
В зерне пшеницы проламины и глютелины составляют 74, альбумины 20-22
и глобулины 5-6 % суммарного белка. Фракция проламинов (глиадина) у каждого
сорта пшеницы насчитывает 17-25 различных белков, всего выявлено 43 вида
глиадинов с молекулярной массой от 16 до 80 кДа. Глиадины α, β, γ, с молекулярной массой соответственно 27-38, 27-41 и 16-18 кДа, состоят из единственной полипетидной цепи, они имеют дисульфидные связи по цистеину. Разрыв этих связей
приводит к фрагментации цепи.
Глютелины (у пшеницы их называют глютенинами) - белки с субъединичной структурой. Они состоят из достаточно гибких полилептидных цепей, связан-
ных ковалентно с помощью дисульфидных мостиков в крупные ассоциаты с моле-
кулярной массой от 100 до нескольких тысяч кДа. Под действием восстановитель-
ных агентов субъединичная структура распадается, что существенно увеличивает
растворимость глютенинов. Поверхностная гидрофобность глютенинов выше, чем
у глиадинов.
Альбуминовая фракция пшеницы представлена белками с молекулярной
массой 11-30 кДа, в среднем 16 кДа.
В семенах масличных и бобовых основной белковой фракцией являются
глобулины. Их доля составляет у арахиса и подсолнечника 97, сои и льна 85-90,
клещевины - около 90, кунжута 80-85, гороха и чечевицы 85-86, вики – 84 % сум-
марного белка. Фракция альбуминов и глютелинов у большинства бобовых и мас-
личных составляет не более чем по 10 %, проламины содержатся в следовых количествах.
32
По соотношению белковых фракций рапс отличается от других масличных.
В безэруковых сортах рапса альбумины составляют 48-62, глобулины 23-30, глютелины 10-16, нерастворимые белки 18-43 %.
Белки семян гороха, сои, арахиса, конопли, подсолнечника, рапса и других
растений содержат два основных глобулина с коэффициентами седиментации 1113S (так называемые 11S-, или легуминоподобные белки), и 7-8S (7S-, или вицилиноподобные белки).
Молекулярная масса легуминов гороха 300-400, подсолнечника 300-350,
рапса 130-150 кДа. Вицилины имеют молекулярную массу в пределах 110-220 кДа.
Вицилиноподобные и некоторые легуминоподобные глобулины являются
гликопротеинами.
Запасные глобулины семян имеют субъединичную структуру, ассоциаты
содержат от 2 до 12 субъединиц. Вицилины гороха - тримеры из субъединиц с молекулярной массой в среднем около 50 кДа. В ассоциации субъединиц глобулинов
могут участвовать дисульфидные связи.
Наличие кислых и основных белков среди субъединиц одного вида глобулина предполагает ионные взаимодействия. Ассоциация субъединиц предохраняет
запасные белки от деградации и способствует сохранению клеточной структуры.
Альбуминовая фракция бобовых и масличных культур состоит из белков
массы 10-100 кДа. В эту фракцию входят биологически активные белки, в том числе протеолитические ингибиторы, лектины. Белки - ингибиторы имеют молекулярную массу 8-25 кДа, для них характерна жесткая структура полипептидной цепи,
скрепленная дисульфидными связями, и наличие складчатых β - структур. Наиболее высокое содержание белков-ингибиторов - у бобовых, в частности, у сои и фасоли. Соевый ингибитор трипсина является классическим примером протеолитиче-
ского ингибитора. Ингибиторы обратимо связываются с соответствующими фер-
ментами, предотвращая гидролиз запасных веществ до момента начала прораста-
ния семени. При прорастании ингибиторы диффундируют во внешнюю среду, что
препятствует инфицированию семян микроорганизмами.
Ингибиторы осложняют процесс ферментативного гидролиза запасных бел-
ков и снижают их пищевую ценность. Действие ингибиторов малоспецифично. Так
33
соевый ингибитор подавляет активность не только трипсина, но и многих других
протеолитических ферментов животного и микробного происхождения, то есть яв-
ляется поливалентным. Для инактивации ингибиторов применяют различные фи-
зико-химические и механические воздействия, например, влаготепловую обработку.
Состав белков подземных запасающих органов растений изучен недостаточно. Считают, что в клубнях и корнеплодах преобладают не запасные, а функци-
ональные белки. В составе белков картофеля идентифицированы глобулин I (тубе-
рин) - 76,4 %, глобулин II - 1,4 %, альбумин – 4 %, проламин - 1,8 %, глютелин - 5,5
%. Туберин локализуется в клеточном соке. Он имеет ферментативную активность.
Некоторые белки клубней имеют антитрипсиновую активность, то есть яв-
ляются протеолитическими ингибиторами. Такая активность наиболее высока у
картофеля.
Белок зеленых листьев достаточно постоянен по составу. Это связано с тем,
что около 75 % листовых белков - это хлоропластные белки, идентичные у разных
видов растений. При получении препаратов белка из листьев выделяется фракция
растворимых белков, две трети которой составляет главный белок листьев - рибулозобисфосфаткарбоксилаза (оксигеназа) РБФК - фермент, катализирующий фото-
синтетическую фиксацию углекислоты и декарбоксилирование в цикле фотодыха-
ния. РБФК является, вероятно, самым распространенным белком на земном шаре,
на долю РБФК приходится 0,2 % всех белков. РБФК стабилен по составу у различных видов растений. Средняя молекулярная масса составляет 546 ± 15 кДа, молекулярная масса большой субъединицы 54,4 ± 1,7 кДа, малой - 13 кДа. РБФК люцерны состоит из 8 больших и 8 малых субъединиц.
В препаратах белка из листьев, помимо белка, содержатся липиды, клетчатка, минеральные и безазотистые вещества. При невысокой степени отчистки белку
сопутствуют пигменты - каротины и ксантофиллы. Наиболее очищенные, так
называемые белые белковые препараты из листьев содержат 89-90 % белка, 0,4-3 %
минеральных веществ, 6,5-9,3 % безазотистых веществ, не более 1 % клетчатки и
0,6 % липидов, пигменты отсутствуют.
34
Гидролиз белка. Белок и пептиды расщепляют ферменты, объединяемые в
подкласс пептидгидролаз. Их называют также протезами, протеолитическими фер-
ментами. Пептидгидролазы расщепляют пептидную связь, которая является одной
из разновидностей амидной связи. Гидролиз идет по схеме (рисунок 3).
Рисунок 3 – Гидролиз белка
Расщепление пептидной связи в точках, удаленных от конца молекулы,
осуществляют эндопептидазы. Их делят на четыре группы: сериновые (3.4.21),
тиоловые (3.4.22), карбоксильные (3.4.23) и металлосодержащие (3.4.24). Отщеп-
ление концевых аминокислот и дипептидов, а также гидролиз дипептидов катали-
зируют экзопептидазы. Экзопептидазы включают пять групп протеолитических
ферментов, важнейшими из которых являются аминопептидазы (3.4.11) и кар-
боксипептидазы (3.4.16, 3.4.17). Схема классификации дана на рисунке 4.
Рисунок 4 - Схема классификации пептидгидролаз
35
Существующая классификация протеолитических ферментов несо-
вершенна, поскольку в ней используются в качестве разграничительных различные
признаки: деление пептидаз на группы проведено по субстратной специфичности,
а протеиназ - по структуре активного центра. В настоящее время описано около
400 пептидгидролаз различного происхождения. На основании этого обширного
материала предлагаются новые варианты классификации, в частности, только по
структуре активного центра.
Гидролиз олигопептидов ограничивается лишь специфичностью действия
пепгидгидролазы, пространственная структура субстрата не является препятстви-
ем.
В белках и полипептидах пептидные связи по своим параметрам практиче-
ски не отличаются от связей, в низкомолекулярных пептидах. Однако в нативных
полимерах на все связи, соответствующие специфичности используемого фермен-
та, могут быть гидролизованы. Часть таких связей остается недоступной действию
фермента из-за особеностей пространственной конформации субстрата.
На доступность пептидных связей гидролизу влияют вторичная, третичная
и четвертичная структуры белков. По характеру вторичной структуры различают
белки, полностью α-спирализованные; белки с преобладанием складчатых βструктур; белки, в которых участки с α- и β- структурой разделены вдоль полипептидной цепи (тип α + β); белки, где α- и β-структуры смешаны (тип α/β). Для многих белков характерно наличие структурированных участков - доменов, соединен-
ных между собой участками с неупорядоченной структурой цепи. Очевидно, что в
упорядоченных структурах определенные участки полипептидной цепи экраниро-
ваны и недоступны действию ферментов. Чем выше степень упорядоченности
структуры, тем менее белок подвержен протеолизу.
Третичная структура белка, его геометрическая форма определяет соотно-
шение экспонированной и экранированной частей молекулы (то есть доступной и
недоступной протеолизу), а также колебания этого соотношения в пределах допу-
стимого изменения конформации нативного белка. Наименее доступны протеолизу
молекулы, форма которых близка к шару.
36
Четвертичную структуру имеют белковые молекулы, состоящие из субъ-
единиц. Последние могут быть ассоциированы за счет ковалентных, ионных и во-
дородных связей. Ассоциация субъединиц снижает относительную величину экс-
понированной части молекулы, увеличивает ее конформационную стабильность за
счет внутримолекулярных взаимодействий.
Ассоцированные молекулы менее доступны действию ферментов, чем дис-
социированные. Равновесие ассоциации - диссоциации сдвигается под влиянием
внешних факторов, таких как реакция среды, ионная сила, присутствие хелатов,
детергентов, восстановительных агентов и пр. Эти факторы могут использоваться
для регуляции ферментативного гидролиза белков, имеющих четвертичную струк-
туру.
Денатурация белков под действием различных физико-химических факто-
ров (высокой температуры, кислой или щелочной реакции среды, высокой концен-
трации мочевины и пр.) приводит к конформационным изменениям, которые в
определенных условиях могут быть необратимыми. Денатурация сопровождается
развертыванием полипептидной цепи, демаскированием прежде экранированых
групп. Снимаются ограничения доступности субстрата, обусловленные вторичной,
третичной и четвертичной структурами. Денатурированые белки гидролизуются в
целом быстрее и полнее нативных. В то же время в процессе денатурации могут
происходить химические реакции, в результате которых вторично экранируются
какие-либо участки полипептидной цепи или претерпевают превращения реакци-
онные группы, существенные для катализа, что препятствует гидролитическому
расщеплению белка.
Различия в пространственной структуре белков, их конформационной по-
движности, доступности тех или иных остатков внешним воздействиям определя-
ют разнообразие субстратной специфичности протеаз.
Физиологическая роль протеаз определяется их участием в белковом об-
мене. Эту роль выполняют как внутриклеточные, так и внеклеточные (секретируе-
мые) протеазы.
37
Промышленные препараты протеолитических ферментов выделяют из сы-
рья, содержащего секретируемые ферменты. Среди них встречаются представители
всех групп эндопептидаз, а также аминопептидазы и карбоксилептидазы.
Сериновые протеиназы объединяют группу ферментов, имеющих в актив-
ном центре каталитически активный остаток серина. Сериновые протеиназы инги-
бируются реагентами, взаимодействующими с этим остатком серина, такими как
диизопропилфторфосфат (ДФФ), фенилметилсульфонилфторид, а также природ-
ными протеолитическими ингибиторами животного, микробного и растительного
происхождения. Все сериновые протеиназы проявляют максимальную активность
в нейтральной или щелочной среде. Молекулярная масса колеблется от 12-15 кДа у
ферментов с единственной полипептидной цепью до 200-300 кДа у ферментов с
субъединичной структурой.
К группе сериновых протеиназ относятся ферменты животного, микробного
и растительного происхождения, многие из которых хорошо изучены и выпуска-
ются в виде промышленных препаратов.
В поджелудочной железе человека и млекопитающих животных синтезиру-
ются сериновые протеииазы - трипсин (3.4.21.4), химотрипсины А и В (3.4.21.1),
химотрипсин С (3.4.21.2). Эти ферменты образуются первоначально в виде пред-
шественников (трипсиногена и химотрипсиногенов), которые превращаются в ак-
тивные формы под действием трипсина. При протеолитическом процессинге трип-
синогена от его молекулы отщепляется N-концевой гексапептид, реакция активируется кальцием.
Активная форма трипсина - однокомпонентный белок, состоящий из един-
ственной полипептидной цепи. Фермент, выделенный из поджелудочной железы
человека и различных млекопитающих, имеет молекулярную массу 22,9-25,5 кДа,
оптимальный pH 7-8. Зона стабильности - при pH не выше 6. В щелочной зоне
происходит самопереваривание. В организме трипсин стабилизируется с помощью
ингибитора, с которым образует неактивный комплекс, устойчивый к протеолизу.
Ингибитор синтезируется в поджелудочной железе. Трипсин гидролизует пептид-
ные связи, образованные карбоксилами аргинина или лизина. Существенно нали-
38
чие свободной аминогруппы диаминокислот по соседству с расщепляемой связью.
Фермент гидролизирует не только амидные, но также сложноэфирные и лактонные
связи. Спектр гидролитического действия трипсина широк. Он расщепляет различ-
ные животные и растительные белки, проявляет высокую активность в отношении
белковых компонентов клеточных стенок микроорганизмов. Комплекс трипсина и
литической мурамидазы - лизоцима, секретируемого слизистой кишечника, являет-
ся важнейшим фактором регуляции состава микрофлоры пищеварительного тракта
животных и человека. Продукты триптического расщепления белков, в особенно-
сти казеина, также влияют на состав кишечной микрофлоры, они действуют на
уровне регуляции автолиза микроорганизмов.
Химотрипсины образуются из химотрипсиногенов после отщепления пеп-
тида, состоящего из 15 аминокислотных остатков. Молекулярная масса химотрипсинов составляет 24-25,8 кДа, оптимальный pH 7-9. Химотрипсины стабильны в
кислой среде. Ферменты предпочтительно катализируют расщепление в белках
пептидных связей, в образовании которых участвуют карбоксилы ароматических
аминокислот. Гидролизуют также связи, образованные карбоксилами лейцина, ме-
тионина, триптофана. Химотрипсины, как и трипсин, расщепляют сложные эфиры
и лактоны. Разнообразие типов гидролизуемых связей определяет широкую специфичность действия химотрипсинов.
В группу сериновых входят многие внутриклеточные протеиназы микроор-
ганизмов. Это секретируемые протеиназы В. subtilis - субтилизины А, В и BPN белки молекулярной массы 26,3-27,5 кДа, активные в зоне pH 8-11; сериновые протеиназы типа субтилизина, продуцируемые различными видами бацилл; мощные
внеклеточные литические протеиназы В. subtilis, Achromobacter lyticus, Myxobacter
- белки молекулярной массы 20-28 кДа с оптимумом при pH 7,8-9; внутриклеточные протеиназы В. subtilis, кишечной палочки, пекарских дрожжей.
Внутриклеточные сериновые протеиназы бактерий гомологичны внекле-
точным, но в отличие от последних, имеют четвертичную структуру и являются
димерами. Ассоциированное состояние препятствует взаимодействию с нативными
белками-субстратами, поэтому внутриклеточные сериновые протеиназы гидроли-
зуют их слабее, чем внеклеточные. Эта особенность внутриклеточных ферментов
39
способствует сохранению функциональной активности нативных цитоплазматиче-
ских белков. Денатурированные белки и пептиды легко расщепляются внутрикле-
точными сериновыми протеиназами.
К сериновым относятся протеиназы А, В, С, Д, Е актиномицета Str. griseus -
белки молекулярной массы 1627 кДа с оптимумом действия при pH 8-10, входящие
в комплекс проназы, а также сходные с ними трипсиноподобные сериновые проте-
иназаы Act. fradiae, Act. rimosus и других актиномицетов.
Различные виды аспергиллов синтезируют внеклеточные сериновые проте-
иназы.
Промышленссть выпускает множество препаратов, в состав которых входят
секретируемые сериновые протенназы. Это трипсин, химотрипсин, панкреатин,
проназа, римопротелин, щелочная бактериальная протеиназа (протосубтилин ще-
лочной), литические протеиназы (лизосубтилин и др.).
Внутреклеточные сериновые протеиназы не выделяют специально в виде
препаратов. Эти ферменты содержатся как сопутствующие во многих гидролити-
ческих ферментных препаратах. Присутствие щелочных сериновых протеиназ в
неочищенных ферментных препаратах может приводить к потере активности по-
следних за счет протеолитической инактивации. Сериновые протеиназы могут дол-
го сохранять активность в препаратах других белков, будучи защищены субстра-
тами.
Тиоловые протеиназы. В эту группу входят пептидгидролазы, для проявле-
ния каталитической активности которых существенна сульфгидрильная группа ци-
стеина. Тиоловые протеиназы ингибируются пара-хлормеркурийбензоатом, йо-
дацетатом и другими оксилителями, а также ионами тяжелых металлов. Активи-
руются тиоловыми агентами и другими восстановителями (меркаптоэтанолом, ци-
стеином, бисульфитом натрия и пр.). Большинство тиоловых протеиназ имеет pH-
оптимум в слабокислой или нейтральной зоне. К тиоловым принадлежат широко
применяемые в практике протеиназы растительного происхождения - папаин, химопапаины А и В, бромелаин, фицин.
40
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]