Морфолого-анатомические и физиологические методы оценки селекционного материала. Учебно-методическое пособие для проведения занятий большого практикум

Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского

С. А. Степанов, М. Ю. Касаткин, В. В. Коробко

МОРФОЛОГО-АНАТОМИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОЦЕНКИ

СЕЛЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА

Учебно-методическое пособие для проведения занятий

большого практикума по физиологии растений для бакалавров

Саратов Издательство Саратовского университета

2021

Генетики и селекционеры ожидают от физиологии растений разработки физиологических критериев для оценки различий сортов, для создания физиологической систематики сортов.

М. Р. Сарич

ВВЕДЕНИЕ

Согласно определению, метод может рассматриваться как способ достижения какой-либо цели, решения конкретной задачи или же как совокупность приемов и операций практического или теоретического познания действительности. В истории биологии можно найти многочисленные примеры, когда изобретение уникального метода приводило к научным открытиям, существенно расширяющим возможности человека. Изобретение микроскопа и последовавшие за этим многочисленные наблюдения биоты привели к созданию клеточной теории, открытие метода разделения веществ посредством хроматографии позволило увидеть многообразный мир молекул и атомов на уровне отдельных компартментов клеток. Не менее существенное значение имеет разработка метода выращивания растений в специальных сосудах, заполненных почвой, песком или водой, в которые добавляли различные химические вещества (вегетационный метод). В дальнейшем это способствовало расширению знаний о минеральном питании растений, открытию способа выращивания растений в теплицах, росту урожайности культурных растений.

Рубежным событием в трансформации метода как инструмента познания материи является реформа научного метода, предложенная Френсисом Беконом (1561–1626), заключающаяся во введении в практику науки знаний, приобретенных в процессе наблюдений или практических действий, в отличие от знаний, достигнутых посредством абстрактного мышления; эксперимент стал рассматриваться как критерий научности отдельных умозаключений. Однако нередко неправильное осмысление фактов, полученных в ходе эксперимента, в случае неадекватности применяемого метода может приводить к устойчивым заблуждениям. Ярким примером является эксперимент Ван Гельмонта по определению природы питания растений. Выращивая иву в ёмкости с почвой в течение нескольких лет, он на основании того, что за этот период времени растение больше всего нуждалось в воде, сделал вывод о водном питании растений. Это мнение просуществовало в науке 200 лет. Только применение изотопного метода способствовало переосмыслению роли воды в питании растений.

3

1. АНАТОМО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДИКИ

Значимость анатомических исследований для селекции наиболее ёмко выразил В. Г. Александров (1937б), известный специалист в области анатомии растений, учебник которого неоднократно переиздавался в России, один из ближайших соратников Н. И. Вавилова. В частности, им отмечалось, что анатомию растений следует рассматривать не только как самостоятельную систему знаний о строении растений, но и как метод для других дисциплин. В 1929 г. Н. И. Вавилов пригласил В. Г. Александрова в ВИР (ныне Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н. И. Вавилова), где он в течение 13 лет руководил лабораторией анатомии культурных растений, а с февраля 1942 г. заведовал сектором экологии растений в Ботаническом институте им. В. Л. Комарова АН СССР (БИН). Вировский период биографии В. Г. Александрова, руководителя впервые организованной в СССР специальной анатомической лаборатории, был очень плодотворным. Труды лаборатории оказали большое влияние на последующее развитие анатомии, особенно культурных растений. В. Г. Александров видел в этом большую и неоспоримую заслугу Н. И. Вавилова. Он писал, что развертывание планомерных исследований по анатомии культурных растений было организовано и осуществлено при благожелательном участии Н. И. Вавилова, поддержке с его стороны и неустанном интересе к этим исследованиям.

В. Г. Александров выделял в анатомии те направления, которые больше всего могли быть полезны растениеводству, считая, что без ее привлечения разрешение ряда проблем, имеющих значение для сельского хозяйства, будет затруднено. К этим основным направлениям он относил прежде всего физиологическую анатомию, а в ней такие разделы, как функциональная, экологическая анатомия и анатомия истории развития, т. е. онтогенеза.

В. Г. Александров – представитель функциональной анатомии, которая раскрывает связь между строением и функцией и выясняет причинность этой связи исходя из положения, что определенная функция теснейшим образом связана с определенными соотношениями в растении. Он придавал большое значение сочетанию физиологического эксперимента с анатомическим анализом. Эксперимент нужен для того, чтобы объяснить структуру растительного организма во всех деталях, получить представление о его организации как субстрата происходящих физиоло-

5

гических процессов. Он широко применял для целей растениеводства методы количественной анатомии, разработанные В. Р. Заленским. Работы В. Г. Александрова и его учеников внесли большой вклад в экологическую анатомию.

Следует отметить, что цели и задачи анатомии растений, поставленные в своё время В. Г. Александровым, требуют и в настоящее время пристального внимания. Достаточно отметить, что до сих пор не существует монографии по описанию анатомии пшеницы – ведущей зерновой культуры мира.

1.1. Методика определения длины листьев зародыша зерновки

Зародыш пшеницы имеет сложную морфологию. В нём различают колеоптиле, почечку главного побега, состоящего из конуса нарастания и зачатков трёх зародышевых листьев, зачатки конусов нарастания боковых побегов, зачатков главного и придаточных зародышевых корней, щиток с лигулой и эпибласт (Эсау, 1969). Длина конуса нарастания главной почки зародыша составляет от 48 до 80 мкм, ширина – от 75 до 100 мкм. Эти параметры конуса зависели от фазы пластохрона (ранняя или поздняя), в которой находился конус побега зародыша каждой индивидуальной зерновки. Длина примордиев листьев (от верхней части их основания) составляла: 1-го – 900 ± 43, 2-го – 277 ± 12, 3-го – 84 ± 4 мкм (Степанов, Даштоян, 2004).

Наблюдаются видовые и сортовые особенности развития конуса нарастания и листьев главной почки зародыша зерновки пшеницы. В частности, для Triticum dicoccum суммарная длина 1–3-го листьев главной почки зародыша составляла 1807 мкм, что существенно больше в сравнении с Triticum durum и Triticum aestivum – соответственно 1544 и 1438 мкм.

Меньшие значения длины 1-го листа наблюдались у Triticum aestivum – 945 ± 27 мкм, тогда как по длине 2-го листа Triticum dicoccum и Triticum aestivum имели близкие значения – соответственно 331 ± 12 и 333 ±

± 14 мкм; по длине 3-го листа отмечены примерно одинаковые значения между Triticum dicoccum и Triticum durum – 168 ± 6 и 166 ± 4 мкм.

Как показали исследования на примере группы сортов яровой мягкой пшеницы, в разные годы вегетации растений наблюдаются устойчивые различия между сортами по состоянию конуса нарастания, который может находиться в поздней фазе 3-го или ранней фазе 4-го пластохронов, а также суммарной длине листьев главной почки зародыша зерновки. Выявлена связь между суммарной длиной листьев зародыша зерновки и площадью развернувшихся, ассимилирующих 1–3-го листьев взрослых растений. В условиях 3 лет вегетации наблюдалось, что большей суммарной длине 1–3-го листьев зародышей зерновок соответствовала большая

6

площадь развернувшихся листьев 1–3-го нижних фитомеров. Величина коэффициента корреляции между суммарной длиной листьев зародыша

иплощадью развернувшихся 1–3-го листьев взрослого растения составляла: 1-й год вегетации – r = 0,85, 2-й год вегетации – r = 0,86, 3-й год вегетации – r = 0,86 (Степанов и др., 2012).

Отмечена тенденция, что если площадь первого листа одного из сортов больше, чем у других сортов, то и в листьях остальных фитомеров до достижения ими максимальных размеров это различие сохраняется. Величина коэффициента корреляции между 1–3-м и 4–6-м листьями взрослых растений пшеницы составляет в разные годы вегетации от r = 0,91 до r = 0,93. В отношении зависимости между площадью листьев средних (4–6-го) и верхних (7–9-го) фитомеров побега выявлено, что величина коэффициента корреляции в разные годы вегетации варьирует от отрицательных (r = 0 −0,27) до положительных (r = 0,68) значений (Степанов

идр., 2012). В значительной мере выявленные зависимости между площадью листьев разных фитомеров побега являются следствием закономерностей роста листьев, установленных ранее (Степанов и др., 2001).

Таким образом, очевидно, что различие сортов по площади листьев отдельных метамеров определяется не только водообеспеченностью растения в период роста листа (Кумаков, 1980), но также степенью развития первых листьев проростков пшеницы. Принимая во внимание значимость быстрого возрастания на ранних этапах развития проростка листовой поверхности, коррелирующей, как правило, с повышенной продуктивностью сортов (Ничипорович, 1980), следует особо учитывать степень развития главной почки зародыша и связанной с ней корневой системы. У разных сортов при кажущихся незначительных различиях в организации их зародыша темпы прорастания неодинаковы (Степанов, Кумаков, 1993), что сказывается на устойчивости сорта к экстремальным факторам, величине его продуктивности (Кумаков, 1985). В качестве оценочного критерия сопряженности роста листьев, их соотносительного влияния друг на друга может выступать соотношение между абсолютной длиной смежных ли-

стьев (коэффициент сбалансированности роста – Kср) в процессе их роста и развития включая этап эмбриогенеза. Анализ сортов разных видов

иформ пшеницы в отношении соотносительной длины листьев – первого ко второму, второго к третьему листу главной почки зародыша зерновок – позволяет рассматривать каждый сорт как потенциально обладающий различной сбалансированностью межфитомерных, донорно-акцепторных отношений уже с момента прорастания зерновки.

Методика. Для определения степени развития листьев главной почки используют неповрежденные, выровненные по размеру семена, взятые из средней части колоса главного побега (n = 20). Перед замачиванием зерновок с помощью вакуумного насоса из них удаляют воздух, затем их по-

7

мещают на 20 ч на фильтровальную бумагу в чашки Петри и смачивают 10 мл дистиллированной воды. Затем зерновки фиксируют в растворе глицерин – 96% этиловый спирт (1 : 1). Через 2–3 суток с помощью МБС-9 (микроскопа стереоскопического) семена препарируют, выделяя из них зародыш. Определение длины 1–3-го листьев эмбрионального побега зародыша проводят до нижнего основания соответствующего листа. Также определяют состояние конуса нарастания – номер и фазу пластохрона. Для оценки аллометрического (соотносительного) роста листьев (Шмидт и др., 1978) к концу эмбриогенеза зародыша зерновки определяют коэффициент сбалансированности роста листьев (Kср) – как отношение длины смежных листьев эмбрионального побега.

Применение методики определения длины листьев зародыша зерновки

По результатам исследования группы сортов яровой мягкой пшеницы показано, что суммарная длина зародышевых листьев варьирует от 1533 до 2123 мкм (табл. 1). Для сортов разных годов репродукции было отмечено, что сорта достаточно стабильны по данному показателю; в частности, сорт Добрыня характеризовался минимальными значениями по данной величине на протяжении трех лет исследований, напротив, сорта Саратовская 73, Саратовская 62, Альбидум 43 отличались стабильно высокими значениями суммарной длины зародышевых листьев.

Изучение линейных размеров листовых примордиев зародыша зерновки показало, что по длине первого зародышевого листа существенные различия отмечены между сортом-реципиентом Добрыня Lr19 и линиями Добрыня Lr19 + Lr24, Добрыня Lr19 + Lr25; достоверные различия были обнаружены: по длине второго листового примордия – между сортомреципиентом и линией Добрыня Lr19 + Lr24; по длине третьего зародышевого листа – между линиями Добрыня Lr19 + Lr24 и Добрыня Lr19 + Lr25.

8

Установлено влияние климатических факторов на степень развития зародыша и толщину оболочки зерновки. Сорта, выращенные на полях Краснокутской опытной станции, характеризуются меньшими размерами зародышевых структур в сравнении с сортами, произраставшими на полях НИИСХ Юго-Востока. Выявлены различия в линейных размерах анатомических структур зерновки под действием света различного спектрального состава. Минимальными значениями всех исследуемых анатомо-морфоло- гических структур отличались зерновки, развитие которых происходило под непрозрачным светофильтром, максимальными – под красным и прозрачным светофильтрами. Транслокации, содержащие гены Lr9, Lr19, Lr24 и Lr25, не только формируют устойчивость к бурой листовой ржавчине, но и оказывают влияние на анатомо-морфологическое строение зерновки.

По результатам анализа развития эмбрионального побега зародыша зерновки озимой мягкой пшеницы выявлены следующие особенности:

1)длина первого зародышевого листа варьирует от 789 (Саратовская 90) до 1097 (Саратовская остистая) мкм;

2)длина второго зародышевого листа составляет от 265 (Мироновская 808) до 453 (Саратовская остистая) мкм;

3)длина третьего зародышевого листа варьирует в пределах от 91 (Саратовская 17) до 154 (Эльвира) мкм (таб. 2).

9

По результатам анализа значений суммарной длины листьев у сортов озимой пшеницы разных лет репродукции было отмечено, что некоторые сорта относительно стабильны по данному признаку. В частности, сорта Саратовская 90 и Виктория 95 на протяжении всех лет исследований отличались минимальными значениями суммарной длины зародышевых листьев, и наоборот, сорта Саратовская остистая и Саратовская 8 характеризовались стабильно высокими значениями данного признака. Остальные сорта в разные годы отличались довольно значительными колебаниями по данному признаку.

Коэффициент сбалансированности роста первого и второго зародышевых листьев (Kср1/2) указывает на особенности донорно-акцепторных взаимоотношений, которые устанавливаются уже в эмбриональном периоде между двумя первыми метамерами. Этот коэффициент может являться показателем потенциала кущения будущего побега. Kср1/2 сбалансированности роста листьев у исследуемых сортов за годы наблюдений был максимальным у сорта Мироновская 808 (3,3), минимальным – у сортов Жемчужина Поволжья (2,0), Саратовская остистая (2,3) и Лютесценс 230 (2,3). Коэффициент сбалансированности роста первого зародышевого листа ко второму в среднем за две репродукции варьировал несущественно у сортов Эльвира, Виктория 95, Губерния, Саратовская остистая и Лютесценс 230. Другие же сорта, напротив, характеризовались достаточно сильными колебаниями по данному показателю. Иное ранжирование сортов отмечалось по коэффициенту сбалансированности второго к третьему зародышевому листу. Kср 2/3 является показателем, характеризующим потенциал развития конуса нарастания. Чем выше его значения, тем больше величина 2-го листа и тем потенциально меньше будет развит главный побег взрослого растения (Степанов, 2001). Наименьшими значениями по данному признаку характеризуются сорта Саратовская 8 (2,2) и Мироновская 808 (2,2), наибольшими – Саратовская остистая (3,6). Kср 2/3 у сортов Саратовская 8 и Мироновская 808 в зерновках разных лет репродукции достаточно сильно варьирует. Относительной стабильностью по данному показателю характеризуются сорта Созвездие, Саратовская 17, Губерния и Саратовская 90.

1.2. Методика определения развития поперечных клеток перикарпа зерновки

Особенности строения оболочек зерновки определенным образом влияют на развитие молодой зерновки. Известно, что синтез АТФ внутри эндосперма связан с поступлением кислорода в процессе дыхания (Rolletschek et al., 2004). Экспериментально доказано, что кислород генерируется перикарпом в процессе фотосинтеза (Nutbeam and Duffus, 1978;

10