Морфолого-анатомические и физиологические методы оценки селекционного материала. Учебно-методическое пособие для проведения занятий большого практикум

хлорофилла a – 55,7, хлорофилла b – 23,4, каротиноидов – 20,9%. В зависимости от фитомерной принадлежности листа доля пигментов составляла: хлорофилла a – от 45,8 до 61,7%, хлорофилла b – от 11,1 до 39,6%, каротиноидов – от 11,7 до 32,8%.

Минимальное относительное содержание (в % от суммарной величины) хлорофилла a наблюдалось в листьях разных фитомеров – от 1-го до 5-го. Максимальное относительное количество хлорофилла a у большинства сортов было отмечено в 5-м листе.

Абсолютное содержание хлорофилла a в среднем составляло 1,07 мг/г сырого веса, от минимума у 3-го листа до максимума для 5-го листа. Однако в отношении каждого из изучаемых сортов пшеницы наблюдаются свои особенности в достижении минимума и максимума содержания хлорофилла a в листьях отдельных метамеров, варьируя от 0,69 до 1,72 мг/г.

Минимальные относительные значения хлорофилла b у большинства сортов были отмечены в 5-м листе – от 11,1 до 20,2%. Максимальные значения хлорофилла b наблюдалась в листьях разных фитомеров – 1–4-м. Таким образом, установлена противоположная зависимость в содержании хлоророфиллов a и b в листьях отдельных фитомеров побега, свидетельствующая об общности путей их синтеза и первоначальном доминировании одного из них – хлорофилла b. Абсолютное содержание хлорофилла b в среднем составляло 0,45 мг/г сырого веса, от минимума у 3-го листа до максимума для 1-го листа. Как и в отношении хлорофилла а, каждому сорту пшеницы свойственны свои особенности в достижении минимума и максимума содержания хлорофилла b в листьях отдельных фитомеров, варьируя от 0,23 до 0,8 мг/г сырой массы.

Минимальное относительное количество каротиноидов было отмечено в листьях 1–5-го фитомеров, однако у большинства сортов в 1-м и 4-м фитомерах. Максимальные значения относительного содержания каротиноидов наблюдались в листьях 3-го, 5-го и 7-го фитомеров, т. е. с очередностью через фитомер. Абсолютное содержание каротиноидов в среднем составляло 0,4 мг/г сырого веса, от минимума у 1-го листа до максимума для 5-го листа. Как и в отношении хлорофиллов, установлена сортоспецифичность в достижении минимума и максимума содержания каротиноидов в листьях отдельных фитомеров, варьируя от 0,12 до 0,83 мг/г сырой массы. Однако у большинства сортов в листьях верхних фитомеров, 5–7-м, наблюдалось большее абсолютное количество каротиноидов.

Таким образом, проведенные полевые исследования показали наличие сортоспецифичности абсолютного и относительного содержания пигментов фотосинтеза в пластинках листьев каждого из фитомеров побега пшеницы.

В лабораторных исследованиях на примере сорта Саратовская 29 установлено, что содержание пигментов фотосинтеза в проростках пше-

31

ницы варьирует в зависимости от условий проращивания. Осмотический стресс вызывает существенные изменения в пигментном комплексе. Так, по абсолютному содержанию хлорофиллов a, b и каротиноидов в проростках максимальное значение пигментов наблюдается при концентрации сахарозы во внешнем растворе 0,001М – соответственно 26,2, 16,7

и10,7 мг/л. Повышение концентрации сахарозы приводило к монотонному снижению концентраций указанных пигментов. При концентрации сахарозы 0,3М содержание хлорофилла a, b и каротиноидов составляло соответственно 0,5; 1,3 и 0,9 мг/л.

По мере усиления осмотического стресса в проростках пшеницы происходит увеличение содержания вспомогательных пигментов (хлорофилла b и каротиноидов). Повышение концентрации пигментов фотосинтеза в листьях в первую очередь происходит за счет каротиноидов.

Оценка содержания каротиноидов у растений, выращенных в абсолютной темноте, показывает, что при любых концентрациях сахарозы в растворе содержание жёлтых пигментов достоверно не изменяется

исоставляет в среднем 0,95 мг/л, тогда как в условиях света концентрация каротиноидов повышается в среднем от 2 до 10 раз. Следовательно, относительно высокий уровень желтых пигментов в проростках можно рассматривать как адаптивную реакцию, направленную на повышение устойчивости фотосинтетического аппарата, предотвращение его фотодинамической деструкции в условиях высокой инсоляции в период засухи

(Кошкин, 2010).

Исследование соотношения концентраций хлорофилла a к хлорофиллу b показало, что повышение осмотического давления внешнего раствора вызывает уменьшение значений данного показателя примерно в 2 раза (с 2,8 при выращивании на дистиллированной воде до 1,5 при любых концентрациях сахарозы). Скачкообразность и унифицированность ответной реакции на внесение во внешнюю среду сахарозы позволяет рассматривать пигментные комплексы проростка как триггерную систему. Это означает, что в ответ на повышение осмотического давления внешнего раствора происходит качественная перестройка пигментных систем. В результате этого большая часть хлорофиллов становится ассоциированной со светособирающим комплексом фотосистем, что является одним из способов адаптации фотосинтетического аппарата к условиям осмотического стресса (Кошкин, 2010; Maslova, Popova, 1993).

Сходная ответная реакция на повышение осмотического давления во внешней среде наблюдается и при оценке соотношения сумм хлорофиллов к каротиноидам. Единственное отличие состоит в более высоком пороге перестройки пигментных систем жёлтых пигментов. Если качественная перестройка хлорофиллов проявлялась уже при 0,001М концентрации сахарозы, то адаптивная реакция каротиноидов начиналась лишь

32

при 0,01М сахарозы (соотношение суммы хлорофиллов к каротиноидам составляет 6,3). Установлено, что при концентрации сахарозы 0,001М наблюдаются переходные процессы для пигментных систем, выражающиеся в небольшом увеличении доли каротиноидов (соотношение суммы хлорофиллов к каротиноидам составляет 3,9) в сравнении с более высокими концентрациями сахарозы.

Таким образом, адаптация проростков к осмотическому стрессу проявляется в увеличении содержания вспомогательных пигментов – хлорофилла b и каротиноидов в листьях. Повышение осмотического давления внешнего раствора приводит к перестройке пигментных систем, которая осуществляется по принципу триггерной системы. Чувствительность пигментных систем проростка к влиянию осмотически активных веществ зависит от особенностей протекания начальных фаз его развития и условий прорастания. В условиях отсутствия освещения осмотический стресс не влияет на содержание каротиноидов в проростке.

2.3.Методика определения активности холинэстеразы

упшеницы

Растение с присущими ему специфическими чертами и сложной организацией требует совершенных систем регуляции и управления жизнедеятельностью (Полевой, 1975, 2001). Присутствие в онтогенезе растения тех или иных типов меристематических клеток, рассматриваемых в данном случае как эффекторные элементы (Кумаков и др., 1994), позволяет поддерживать экологическую пластичность вида в определенном режиме. Предполагается (Степанов, 1993; Степанов, Головинская, 2001), что нейромедиаторы, и соответственно, эргические системы, выступают в качестве морфогенных химических факторов, посредством которых центральные элементы управления (Зубкус, 1979) осуществляют регуляцию функциональной целостности растительного организма.

Каждый фитомер в силу своего неравнозначного влияния на онтогенез должен обладать свойственным только ему уровнем функциональной активности эргических систем. Очевидно, доминирующее влияние одних фитомеров должно переходить к другим, значение которых на данном онтогенетическом этапе более существенно, т. е. в онтогенезе постоянно должна осуществляться настройка каждого из фитомеров с сохранением общей тенденции поддержания целостности растения. В конкретных условиях среды каждый фитомер выполняет роль своеобразного буфера с целью поддержания общего гомеостаза растительного организма (Степанов, 1993; Кумаков и др., 1994).

В сравнении с другими системами особое значение в ходе эволюции приобрела холинэргическая система регуляции, наличие которой у рас-

33

тений, возможно, служит доказательством всеобщего молекулярного механизма явления раздражимости (Гунар, 1953; Рощина, 1991; Степанов, 1993). Её роль в адаптации растений и поддержании гомеостаза растительного организма слабо изучена. Исследования в этой области могут дать ключ к пониманию фундаментальных процессов стресса у растений, что важно для практики сельского хозяйства.

Холинэргическая система регуляции включает в себя четыре компонента – ацетилхолин, холинорецептор, фермент синтеза ацетилхолина холинацетилтрансферазу и фермент его гидролиза холинэстеразу (ХЭ). Начало систематическим исследованиям холинэстеразы растений было положено в 60-е годы XX столетия (Dettbarn, 1962; Рощина, 1991). В серии работ Джаффе и др. (Riov, Jaffe, 1973ab; Fluck, Jaffe, 1974ab), Maгешвари (Maheshwari et al., 1982), В. В. Рощиной и др. (1984, 1990), Гупта (Gupta, Gupta, 1997; Gupta et al., 2001) с экстрактами растительных тканей показано, что это явление присуще многим высшим растениям: Chenopodiaceae, Convolvulaceae, Cruciferae, Graminae (Zea mays L.), Fabaceae, Mimosaceae, Solanaceae, Urticaceae и др. Особенно часто холинэстеразная активность обнаруживается у видов семейства Leguminosae, в основном в корнях

(Рощина, 1991; Momonoki, Momonoki, 1993).

Холинэстеразная активность обнаружена у эмбрионов и в клетках алейронового слоя семян пшеницы, овса, тыквы. Она отмечена на стадии дифференциации корней и стеблей в эпидермисе, флоэме, камбии и апикальных меристемах этих растений (Tretyn et al., 1986).

В исследованиях Момоноки (Momonoki, 1997) отмечено асимметричное распределение фермента в колеоптиле, колеоптильном узле и мезокотиле гравистимулируемых проростков кукурузы. Наибольшая активность ацетилхолинэстеразы отмечена на нижней стороне горизонтально расположенных проростков кукурузы. Показано также различие в активности ХЭ разных тканей корня – коры, паренхимы стелы, проводящих пучков. При ингибировании ХЭ неостигмином наблюдалось блокирование гравитропизма проростков кукурузы (Momonoki, 1992, 1997).

Регулирующая функция ацетилхолина и холинэстеразы в ростовых фотоморфогенетических реакциях была установлена в 1970-е годы (Jaffe, 1970; Evans, 1972). Ацетилхолин оказывает в основном стимулирующее действие на прорастание семян, спор грибов и пыльцы растений (Tretyn, Tretyn, 1988; Рощина, 1992). Жолкевич В. Н. и соавторы (1989, 1997) обна-

ружили значительную (на 40–50% от контроля) стимуляцию ацетилхолином корневого давления у подсолнечника Helianthus annus и экссудации ксилемного сока проростками кукурузы Zea mays. Полученные данные эти исследователи связывают с действием медиатора на сократительные системы проводящих элементов растений. Установлено (Рощина, Мухин, 1987аб), что ацетилхолин и ацетилхолинэстеразная система в хлороплас-

34

тах участвуют в регуляции проницаемости мембран и фотофосфорилирования. В литературе отсутствуют сведения о сортовой специфичности пшеницы в отношении отдельных компонентов холинэргической системы.

Все методы определения активности холинэстеразы основаны на выявлении количества продуктов реакции или количества оставшегося неразрушенным ацетилхолина. Их классифицируют (Голиков, Розенгарт, 1964; Франке и др., 1973) на 6 групп:

1)методы, основанные на определении количества уксусной кислоты, образующейся в результате гидролиза ацетилхолина под влиянием ХЭ:

а) манометрический – по количеству CO2, выделившегося при реакции между уксусной кислотой и щелочью;

б) титрометрический – выполняется путем титрования с индукто-

ром или с помощью pH-метра;

в) фотометрический – по изменению цвета реакционной среды в присутствии индикатора определяется концентрация кислоты;

г) pH-метрический – путем прямого измерения pH раствора;

2)методы, основанные на определении других продуктов гидролизованного субстрата:

а) тиохолиновые;

б) с использованием специальных субстратов.

Наиболее часто используется для определения продуктов гидролиза ацетиотиохолина в растительных объектах метод Эльмана (Ellman et al., 1961; Gorun et al., 1978), недостатком которого является обязательное отсутствие в субстрате окрашенных продуктов (пигментов и других соединений), которые могут мешать анализу (Рощина, 1991);

3)методы, основанные на определении количества неразложившегося ацетилхолина:

а) биологические; б) химические;

4)ультрамикрометоды – определение активности ХЭ в чрезвычайно малых объемах ткани;

5)экспресс-методы. Используются для быстрого определения, упрощены;

6)гистохимические методы (Koelle, Friedenwald, 1949; Koelle, 1955; Momonoki, Momonoki, 1993; Рощина и др., 1994);

7)радиоизотопный метод (Miura et al., 1982).

В исследованиях пшеницы для определения активности ХЭ как ос-

новного показателя активности холинэргической системы регуляции рекомендуем метод Хестрина (Chestrin, 1949), ранее апробированный на животных объектах (Муравьева, 1961; Панюков, 1966; Франке и др., 1973). Являясь достаточно надежной и точной, методика Хестрина нашла ши-

35

рокое применение во многих зарубежных и отечественных исследованиях для определения суммарной холинэстеразной активности (Муравьева, 1961; Франке и др., 1973). На растительных объектах метод впервые ис-

пользовался в 1960-е годы (Dettbarn, 1962; Nakajima, Hatano, 1962).

Активность ХЭ выражают или в относительных единицах (в единицах оптической плотности), или в миллиграммах (микромолях, нанномолях) субстрата, гидролизуемого в течение 60 мин при 28–37° С ферментом, содержащимся в 1 г ткани (Nakajima, Hatano, 1962; Панюков, 1966; Франке

идр., 1973).

Воснове метода лежит определение ацетилхолина, оставшегося после инкубации с ферментом или ферментами исследуемого объекта. Гидроксиламин в щелочной среде вступает в реакцию с эфирами низкомолекулярных кислот с образованием гидроксамовой кислоты, которая

с FeCl3 дает хорошо растворимый пурпурно-коричневый комплекс. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации гидроксамовой кислоты и, как следствие, концентрации ацетилхолина (Chestrin, 1949; Муравьева, 1961; Dettbarn, 1962; Панюков, 1966).

Об активности ХЭ судят по разности между количеством взятого субстрата и оставшегося не разложившимся после инкубации с ферментом, т. е. по количеству гидролизованного ацетилхолина за определенный промежуток времени при определенной температуре и pH субстрата:

CH3COOR + NH2OH + NaOH = CH3CO/NHONa/ + ROH + H2O,

CH3CO/NHONa/ + HC1 = CH3CO/NHOH/ + NaCl,

CH3CO/NHOH/ + FeCl3 = 3HC1 + Fе[CH3CO/NНОН/]3.

Образование комплекса происходит при pH 1,2–1,4.

Реактивы:

1)фосфатный буфер pH 7,8,

936 мл Nа2HPO4 + 64 мл KH2PO4, 915 мл Nа2HPO4 + 85 мл KH2PO4,

1/15 М р-р KH2PO4 – 0,9078 г KH2PO4 + H2O до 100 мл,

1/15 М р-р Na2HPO4 2H2O – l1,866 г Na2HPO4+H2O до 1000 мл,

2)ТХУ 50% – 500 г ТХУ + 500 г H2O,

3)NaOH 3,5 н р-р – 140 г NaOH + H2O до 1000 мл,

4)ГАМ солянокислый 2 М р-р – 13,9 г NH2OH HCl + H2O до 100 мл (хранить в холоде),

5)НС1 /1:2/ – 1 ч НС1 +2 ч H2O,

6)FеС13 0,37 М р-р 100 г FеC13 + НС1 до 1000 мл HC1 р-р – 1 фиксанал 0,1 экв. HCl + H2O до 1000 мл,

36

7)ацетилхолинхлорид – 0,6% р-р на бидистилляте.

Оборудование:

1)термостат,

2)ФЭК (КФК-2) λ – 540 нм (зеленый светофильтр), кювета на 5 мл.

Методика. Работа проходит по плану (Панюков, 1966; Щеглова и др., 1997) в соответствии с табл. 5.

Последовательность выполнения работы

1. Навеска исследуемой ткани массой 300 мг подвергается тщательной гомогенизации в присутствии воды, буфера, толченого стекла в соответствующих количествах. Добавление ацетилхолинхлорида осуществляется непосредственно перед термостатированием в течение 60 мин при температуре 28° С.

Таблица 5

Реактивы и последовательность выполнения операций

2.Приготовление фильтрата. После добавления 0,5 мл ТХУ исследуемая смесь помещается в холод на 5 мин. Фильтрация проводится при помощи центрифуги (10 мин при 6000 об.). Фильтрат может храниться

втечение 2–3 ч на холоде.

3.Добавление последующих реактивов (ГАМ, HCl, FeCl3) к 1,5 мл фильтрата проходит с интервалом в 2 мин при тщательном перемеши-

вании во избежание образования пузырьков CO2 на стенках кюветы при фотометрировании. Причиной данного обстоятельства, вероятно, является щелочь. Раствор щелочи (NaOH) содержит большое количество примесей

(NaCl, Na2CO3, Na2SiO3 и т. д.), некоторые из них являются источником CO2. Во избежание этого готовят 50% раствор NaОН, т. к. при подобной концентрации многие примеси не растворяются и легко уходят в осадок. Декарбоксилирование проводят с помощью хлоркальциевой трубки, наполненной натронной известью или аскаритом, который в несколько раз эффективнее натронной извести. Отстоявшийся раствор отделяют от осадка и в дальнейшем используют для приготовления щелочи необходимой концентрации.

37

Раствор ГАМ и щелочи (1 : 1) готовят непосредственно перед работой. Смесь пригодна в течение 3 ч при комнатной температуре.

4. Немедленное фотометрирование, что связано с подвижностью цветной реакции раствора.

Формула подсчета активности ХЭ:

A = [Kопт −(Оп −Ф)] ·n ·3 мг/мин·г,

Kопт ·M ·T

где A – активность холинэстеразы;

Kопт – оптическая плотность контрольной пробы; Оп – оптическая плотность опытной пробы; Ф – оптическая плотность фоновой пробы; n – разведение исследуемой пробы (0,33); 3 – навеска ацетилхолинхлорида в 0,5 мл раствора; M – масса ткани, г; T – время инкубации, мин.

Как было установлено Хестриным (Chestrin, 1949), кроме эфиров холина, гидроксамовую кислоту с гидроксиламином образуют эфиры низкомолекулярных жирных кислот, ацильные эфиры дикарбоновых кислот (щавелевой, янтарной, малоновой), лактоны, ацилглициндикетопиперазин, триацетин, трибутирин и некоторые другие соединения вторичного метаболизма (Лукнер, 1979). В тех случаях, когда в исследуемой ткани имеются подобные вещества, необходимо для их определения ставить фоновую пробу с исследуемой тканью (Панюков, 1966; Щеглова и др., 1997).

Для выявления специфичности определяемый эстеразы возможно использование ингибитора холинэстераз прозерина в концентрации 10−5М.

Применение методики определения активности холинэстеразы у пшеницы

Впервой серии экспериментов в лабораторных условиях определялась активность ХЭ у 4- и 7-суточных проростков яровой пшеницы Саратовская 36 в следующих частях: зародышевые корни, первый лист, колеоптиль и базальная часть побега, состоящая из нижней части первого листа, зачаточных 2–4 метамеров.

Максимальная активность ХЭ наблюдалась в зародышевых корнях 7-суточных проростков пшеницы. У 4-суточных проростков активность ХЭ зародышевых корней составляла 45% активности ХЭ у 7-суточных проростков.

Минимальные значения активности ХЭ отмечались у 4-суточных проростков пшеницы в колеоптиле. Они были примерно в 8 раз меньше активности ХЭ в зародышевых корнях.

Вполевых условиях абсолютные значения активности ХЭ в узлах стебля примерно в 2 раза выше, чем в проростках пшеницы. Наименьшая активность ХЭ в начале наших исследований выявлена в 1–3-м узлах, большая – в 5-м узле стебля. Перед началом цветения значительно

38

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Александров В. Г. О строении покровов зерновки злака // Бот. журн. 1937а. Т. 22, № 4. С. 364–392.

Александров В. Г. Анатомия растений. М. ; Л. : Сельхозгиз, 1937б. 378 с. Александров В. Г. О строении эндосперма зерновки злака // Бот. журн. 1939.

Т. 24, № 1. С. 58–92.

Александров В. Г., Александрова О. Г. Анатомия зерновки пшеницы // Тр. БИН им. В. А. Комарова АН СССР. 1948. Сер. 1. Вып. 7. С. 263–334.

Алиев Д. А., Азизов И. В., Казибекова Э. Г. Фотосинтетическая способность и развитие хлоропластов в онтогенезе пшеницы. Баку : Элм, 1988. 116 с.

Андреева А. Ф., Игошин А. П., Кумаков В. А. Способ оценки засухоустойчивости колосовых культур : а. с. / 1706 426. Б. И. 1991. № 3. С. 1–10.

Батыгина Т. Б. Хлебное зерно / Бот. ин-т им. В. А. Комарова. М. : Наука, 1987. 43 с.

Бороевич С. Принципы и методы селекции. М. : Колос, 1984. 344 с. Вигоров Л. И. Микроскопическая структура клеток алейронового слоя зерно-

вок мягких пшениц // Докл. АН СССР. 1954. Т. 98, № 3. С. 479–482. Гавриленко В. Ф., Жигалова Т. В. Сравнительный анализ активности энерго-

преобразующих систем хлоропластов пшеницы различной продуктивности // Науч. докл. высш. школы. Биол. науки. 1980. № 1. С. 5–9.

Гавриленко В. Ф., Жигалова Т. В. Большой практикум по фотосинтезу. М. : Академия, 2003. 256 с.

Гамалей Ю. В. Надклеточная организация растений // Физиология растений. 1997. Т. 44, № 6. С. 819–846.

Гамалей Ю. В. Фотосинтез и экспорт фотосинтатов. Развитие транспортной системы и донорно-акцепторных отношений // Физиология растений. 1998. Т. 45, № 4. С. 614–631.

Голиков С. Н., Розенгарт В. И. Холинэстеразы и ацетилхолинэстеразные вещества. Л. : Медицина, 1984. 117 с.

Градчанинова О. Д., Гудкова Т. И. Эволюция защитных покровов семян хлебных злаков // Адаптация и рекомбиногенез у культурных растений : тез. докл. Всесоюз. конф. Кишинев : Б. и., 1979. С. 78–79.

Гунар И. И. Проблема раздражимости растений и дальнейшее развитие физиологии растений // Известия ТСХА. 1953. Вып. 2. 26 с.

Добрынин Г. М. Рост и формирование хлебных злаков. Л. : Колос, 1969. 275 с. Дунаева С. Е. Ультраструктура поперечных клеток мезокарпия зерновки

Tr. aestivum // Бот. журн. 1982. Т. 67. С. 526–532.

40