Морфолого-анатомические и физиологические методы оценки селекционного материала. Учебно-методическое пособие для проведения занятий большого практикум

Caley et al., 1990). Его фотосинтетическая активность связана с содержани-

ем хлорофилла (Evans and Rawson, 1970; Caley et al., 1990). Содержание хлорофилла увеличивается во время промежуточной фазы роста, немедленно следуя за индукцией фотосинтезсвязанных генов (Sreenivasulu et al., 2004). C использованием лазерной сканирующей микроскопии было показано, что хлорофилл локализован в определенных слоях перикарпа, поперечных клетках, покрывающих весь эндосперм кроме области жилки и нуцеллярного эпидермиса. Состояние этого хлорофиллоносного слоя позволяет предположить, что фотосинтез (образование кислорода) играет определяющую роль в росте зерна (Rolletschek et al., 2004).

Состояние концентрационного градиента явно указывает, что кислород образуется с высокой скоростью внутри хлорофиллсодержащего слоя перикарпа и направляется во все области: и в эндосперм, и во внешний перикарп. Резкое снижение количества кислорода внутри эндосперма в течение стадии запасания указывает на интенсивное его потребление вследствие высокой метаболической активности. Интегумент, связанный с эндоспермом (исключая область жилки) (Zee, O’Brein, 1970), очевидно позволяет извлекать кислород путем диффузии по концентрационному градиенту. Тем не менее он может мешать газообмену (Cochrane, Duffus, 1979) и это может быть причиной выравнивания градиентов. Существуют предположения, что роль фотосинтезирующего перикарпа, а именно представленных в нём поперечных клеток, состоит в большей степени в поставке кислорода в эндосперм, чем в фиксации углекислого газа (только 2% крахмала эндосперма приходится на фотосинтез поперечных клеток) (Watson, Duffus, 1988).

Поперечные клетки в большей части зерна имеют размеры 100– 150 мкм × 15–20 мкм, а толщина клеток составляет 5–7 мкм; по данным других исследователей, длина поперечных клеток достигает 200–300 мкм (Меджель и др., 1968). Средняя толщина поперечных клеток пшеницы Полония составляет 10,1 мкм на верхней половине зерна, по бокам зерна, на щечках и по бокам бороздки. На спинной части зерна и над зародышем клетки примерно на 50% толще. Стенки этих клеток вытянуты и на концах этих клеток тоньше, чем на боковых частях (Меджель и др., 1968). Характерной чертой поперечных клеток T. durum следует считать, по мнению ряда авторов (Александров, Александрова, 1948), причленение клеток друг к другу, особенно выраженное на боковых и отчасти на брюшной сторонах зерновки. Наиболее заметное различие между разными формами пшениц выявлено в морфологии поперечных клеток, именно в ширине их и в толщине оболочки (Александров, 1937a).

Методика. Для изучения особенностей развития поперечных клеток перикарпия зерновок берут пробы во время развития зерна от момента цветения через каждые 4 дня, а по завершении налива зерновки измеряют

11

окончательные размеры поперечных клеток. Семена, взятые из средней части главного побега (n = 50), фиксируют раствором Гамалунда (Прозина, 1960), после чего с помощью МБС-9 выделяют поперечные клетки перикарпа и измеряют окуляр-микрометром их длину и ширину в различных частях зерновки – в области спинки, щечек и зоны, прилегающей к бороздке. Для сравнительного анализа сортов возможно измерение в одной из зон, лучше в области спинки зерновки, т. к. параметры поперечных клеток на этом участке наиболее стабильны.

Применение методики

Для определения сортовых особенностей развития поперечных клеток в лаборатории физиологии растений НИИСХ Юго-Востока исследовали пять сортов яровой твёрдой пшеницы саратовской селекции: Гордеиформе 432, Саратовская золотистая, Валентина, НИК и Елизаветинская.

В области спинки на начальных этапах развития (9-й день после массового цветения) зерновки наименьшее значение длины поперечных клеток отмечено для сорта Гордеиформе 432 и составляет 21,5 мкм (рис. 1), а большее для крупнозерных сортов НИК и Елизаветинская – 31,6 и 31,2 мкм соответственно, а ширина не превышает 12–17 мкм.

Рис. 1. Длина поперечных клеток в области спинки зерновок T. durum

Клетки паренхимные по форме, не содержат хлоропластов. Уже на 11-й день после массового цветения в этих клетках отмечается наличие хлоропластов. В течение трех последующих недель в период роста зерновки и вплоть до стадии молочной спелости поперечные клетки очень активно растут, после чего скорость роста замедляется и прекращается на поздних стадиях молочной спелости. В момент достижения попереч-

12

ными клетками их окончательных размеров были получены следующие значения: наибольшая длина отмечена для крупнозерных сортов НИК (137,2 мкм), Елизаветинская (123,8 мкм), Валентина (111,5 мкм), а меньшая для стародавнего сорта Гордеиформе 432 (98,9 мкм). Изменения же ширины поперечных клеток не столь заметны и составляют среди исследованных сортов от 12 до 19 мкм.

В области щечек зерновок изначальные значения длины колебались от 25,6 мкм у сорта Гордеиформе 432 до 38,132 мкм у сорта НИК. Так же как и в области спинки, в этой зоне наиболее активное увеличение длины поперечных клеток совпадает с периодом роста зерновки и замедляется на стадии поздней молочной спелости. На ранней стадии восковой спелости наибольшая длина отмечена у сортов НИК (210,4 мкм), Валентина (198,8 мкм), Елизаветинская (201,1 мкм), а меньшая у сорта Гордеиформе 432 (150,5 мкм). Ширина же с момента начала измерений до их окончания практически не меняется и колеблется от 11 до 17 мкм.

Меньшая длина поперечных клеток, находящихся в районе бороздки, на ранних этапах развития зерновки отмечена у сорта Гордеиформе 423 (18,1 мкм), а большая у Елизаветинской (36,8 мкм). Активный рост поперечных клеток в области бороздки продолжается на 3–6 дней дольше, чем

востальных областях зерновки. Наибольшие окончательные размеры этих клеток характерны для сортов НИК, Елизаветинская и Саратовская золотистая – 213,1, 191,1 и 176,5 мкм соответственно, а наименьшая опять же для сорта Гордеиформе 432 (177,5 мкм). Ширина же поперечных клеток

вобласти бороздки несколько больше, чем в других областях, но, так же как и в остальных областях зерновки, увеличивается незначительно – от 11–18 до 12–19 мкм.

Исследование динамики роста поперечных клеток показывает, что наиболее активное разрастание поперечных клеток наблюдается в области бороздки и щечек в сравнении с клетками, находящимися в области спинки. Так, возле бороздки длина поперечных клеток у сортов Гордеиформе 432 и НИК увеличивается в 10 раз, у сорта Валентина – в 8 раз, у Саратовской золотистой – в 7 раз. На щечках зерновок у сортов НИК и Валентина эти клетки увеличиваются в 6 раз, у сортов Гордеиформе 432 и Саратовская золотистая – в 5 раз, у Елизаветинской – в 4,5 раза; в области спинки у сортов Елизаветинская, НИК, Гордеиформе 432 – в 4 раза, у сортов Валентина и Саратовская золотистая – в 3–3,5 раза. Подобные результаты получены ввиду того, что на спинке зерновки меньше отражается натяжение, производимое в процессе налива зерна.

Различия отмечены и по форме поперечных клеток в разных районах зерновки. В области спинки и щечек поперечные клетки почти правильной формы, сильно вытянуты, но клетки, прилегающие к бороздке, имеют более толстые клеточные стенки, а форма самих клеток становится изви-

13

листой, клетки располагаются по отношению к бороздке под некоторым углом. Во всех участках зерновки отмечается то, что иногда место одной клетки занимают две или на том месте, где могли бы располагаться две клетки, находится одна.

Отличаются эти клетки и содержанием хлоропластов. При исследовании первой пробы (9-й день после массового цветения) зеленые пластиды не обнаруживаются; на 11-й уже появились некрупные хлоропласты. На второй неделе исследования (15-й день после массового цветения) клетки буквально набиты крупными хлоропластами. К четвертой неделе исследования (на 27-й день после массового цветения) поперечные клетки почти полностью теряют хлоропласты, но обнаруживаются в области спинки сорта НИК, а также небольшое их количество в некоторых поперечных клетках сорта Гордеиформе 432. К окончанию периода молочной спелости поперечные клетки полностью теряют хлоропласты, а также происходит деструкция протопласта. Подобные наблюдения были отмечены ранее и для мягкой пшеницы (Дунаева, 1982).

Вначале периода восковой спелости были проведены исследования по определению размеров поперечных клеток всех 28 исследуемых сортов. Длина поперечных клеток в области спинки колебалась от 81,2 (Людмила, Алтайский янтарь, Алейская) до 132,2 (Елизаветинская) мкм. В области щечек наибольшая длина этих клеток отмечена у сорта Валентина и составляла 194,8 мкм, а наименьшая у сорта Безенчукская 182 – 120,8 мкм. Среди поперечных клеток, прилегающих к бороздке, минимальная длина характерна для сорта Алтайский янтарь (90,2 мкм), а максимальная – для сорта Золотая волна (178,1 мкм). Проведенные исследования показывают, что изучаемые нами сорта существенно отличаются по размерам поперечных клеток в различных частях зерновки, и следовательно, этот признак является в достаточной степени сортоспецифичным.

Подобные исследования были проведены и для яровой и озимой форм мягкой пшеницы и подтвердили закономерности, отмеченные при изучении твёрдой пшеницы.

1.3.Методика определения площади алейроновых клеток эндосперма зерновки

Вботаническом отношении алейроновый слой – это наружный слой эндосперма, но мукомолы рассматривают его как часть оболочек. Алейроновый слой составляет от 6 до 8% веса зерновки (Александров, 1939). Он состоит из одного ряда крупных клеток величиной от 30 до 70 мкм

ипочти полностью окружает зерно поверх крахмалистого эндосперма. С внешней стороны алейроновый слой тесно прижат к гиалиновому слою (Градчанинова, Гудкова, 1979; Кретович, 1991). По размерам клеток алей-

14

ронового слоя установлены видовые и сортовые различия (Вигоров, 1954; Тортинская и др., 1963). У ряда сортов его толщина колеблется от 32 до 55 мкм и в среднем равняется 46, у других пшениц – от 37 до 65 мкм и в среднем равна 46,9. Толщина алейронового слоя над зародышем составляет 8,8–19 мкм, в среднем 13,4 мкм, т. е. менее одной трети толщины этого слоя в любом другом месте. Доля этого слоя у дикорастущих пшениц обычно выше, чем у культурных (Яковлев, 1950). По данным М. Меджель и др. (1968), алейроновый слой имеет толщину 65–70 мкм. Показано различие сортов в интенсивности формирования алейронового слоя (Худяк, 1963).

Клетки алейронового слоя состоят из клеточной стенки, протоплазмы, крупного ядра и шаровидных полупрозрачных зерен размером 1,5– 6 мкм (Вигоров, 1954). Белок состоит из так называемых алейроновых зерен (отсюда и происходит название слоя); клейковина здесь отсутствует (Градчанинова, Гудкова, 1979). По размеру алейроновые зерна различных сортов мягких пшениц отличаются сравнительно мало, тогда как размер зерен в одной клетке варьирует начиная от одного микрометра и до величины максимальной для данного вида и сорта. Например, в клетках Лютесценс 62 размер алейроновых зерен изменяется от 1,5 до 6 мкм при преобладающем размере зерен 4,5 мкм (Вигоров, 1954).

Клетки алейронового слоя эндосперма с его жизнедеятельными ядрами и плазмой очень богаты запасами жира, сахаров, а также аминокислот амидов и других небелковых форм азота; в них содержатся обильные запасы фосфора в составе фитина, глобоидов и значительное количество минеральных веществ, в особенности калия, играющего важную роль в развитии меристематичеких тканей. Кроме того, в алейроновом слое отмечена относительно высокая концентрация эндогенного кальция (Noda, Fukuda, 1998). Все эти вещества накапливаются в алейроновом слое в количествах, значительно превышающих содержание их в глубоколежащих клетках эндосперма (Цингер, 1958; Noda, Fukuda, 1998). У некоторых видов и сортов пшениц белок в алейроновом слое кристаллизуется в виде отчетливо выраженных кристаллоидов. Крахмал в клетках алейронового слоя не обнаружен (Добрынин, 1969).

Клеточные стенки алейроновых клеток характеризуются отсутствием одревеснения. Наличие в клеточных стенках алейроновых клеток студневидных углеводов свидетельствует о пониженной проницаемости клеточных стенок алейроновых клеток для пищеварительных ферментов и объясняет отчасти неперевариваемость содержимого алейроновых клеток, находящихся, например, в муке цельномолотого зерна (Вигоров, 1954).

Ряд исследователей указывает (Вигоров, 1954; Ивановская, 1965), что клетки алейронового слоя, окружающего эндосперм в зрелой зерновке пшеницы, не однотипны и отличаются по морфологии в зависимости от их

15

месторасположения в зерновке. На продольном срезе можно различить три основные зоны и, соответственно, три типа алейроновых клеток – это клетки спинной стороны зерновки, брюшной (щечек) и пристенный алейроновый слой, заходящий за зародыш (Ивановская, 1965).

Из проведенных многочисленных наблюдений установлено, что клетки алейронового слоя возникают исключительно из клеток наружного, пограничного слоя эндосперма. Согласно Т. Б. Батыгиной (1987), дифференциация алейронового слоя начинается вскоре после завершения образования клеточного эндосперма (10–12-е сутки). Конец формирования алейронового слоя совпадает с началом дифференциации зародыша (Худяк, 1963). Алейроновый слой появляется впервые на спинной стороне зародышевого мешка, противоположной бороздке, в виде мелких густо окрашивающихся клеток.

Для понимания функций алейронового слоя проводились разнообразные исследования не только на примере пшеницы, в качестве объекта исследования использовались и другие злаки. На примере риса было показано, что алейроновый слой развивающегося кариопсиса риса является первой по положению тканью, которая передает свободную сахарозу в апопласт эндосперма от созревающего нуцеллуса. Выработка клетками алейронового слоя ферментов отмечалась и в ряде других работ (Betheke et al., 1997; Ким, 2008).

Показано, что алейроновый слой обеспечивает устойчивость к тепловому шоку (Shaw, Brodl, 2003). В результате проведенных исследований алейронового слоя ячменя были получены сведения о том, что во время теплового воздействия происходит увеличение синтеза фосфатидилхолина, в результате чего повышается количество жирных кислот, извлеченных из фосфатидилхолина, и как следствие, происходит увеличение устойчивости мембран шероховатого эндоплазматического ретикулума, участвующе-

го в синтезе секреторных белков (Grindstaff et al., 1996; Shaw, Brodl, 2003).

Таким образом, происходит приспособление алейронового слоя к высоким температурам, на что указывают возобновление синтеза α-амилазы и восстановление ламелл эндоплазматического ретикулума, которые имеют более высокий уровень насыщенных жирных кислот фосфолипидов мембран

(Campbell et al., 1997; Shaw, Brodl, 2003). Подобные изменения были отме-

чены и в мембранах хлоропластов жаростойких растений (Pearcy, 1978). Методика. Для изучения степени развития алейроновых клеток ис-

пользуют неповрежденные, выровненные по размеру семена, взятые из средней части колоса главного побега (n = 20–40). Определение особенностей развития клеток алейронового слоя проводят на свежеприготовленных или фиксированных (глицерин : спирт – 1 : 1) объектах на поперечных срезах средней части зерновки. Срезы окрашивают метиленовым синим, после чего измеряют клетки алейронового слоя в области спинки, щечек

16

зерновки, а также в зоне, прилегающей к бороздке. Для сравнительного анализа сортов возможно измерение в одной из зон, лучше в области спинки зерновки, т. к. параметры алейроновых клеток эндосперма на этом участке наиболее стабильны.

Применение методики

При анализе зерновок сортов твердой пшеницы обнаружены различия по степени развития клеток алейронового слоя в разных частях зерновки. Длина клеток алейронового слоя в области спинки зерновки варьирует от 40,7 (Елизаветинская) до 64,38 мкм (Крассар), в области щечек от 37,3 (Безенчукская 200) до 62,9 мкм (Крассар), в области бороздки от 36,63 (Аннушка) до 55,13 мкм (Belikh 2) (табл. 3).

В процессе изучения клеток алейронового слоя было отмечено, что большим клеткам алейронового слоя в районе спинки зерновки соответствуют большие клетки в области щечек и бороздки, и напротив, маленьким алейроновым клеткам в районе спинки зерновки соответствуют небольшие клетки в остальных изучаемых зонах зерновки. На основании полученных данных можно выявить следующую закономерность: клетки алейронового слоя имеют большую длину в области спинки, а меньшую – в области бороздки и щечек. Но, тем не менее, выявлен ряд сортов, у кото-

17

2.ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДИКИ

Вистории развития биологии можно выделить три основных направления – редукционизм, органицизм и интегратизм. Доминирование

внастоящее время первого из них, редукционизма, проявляемое во всё большей дифференциации наук, наряду с успехами в решении отдельных частных вопросов порождает проблемы с осознанием «монблана фактов», проявляющихся нередко фрагментарно в феномене жизни на более сложных уровнях её организации. Считается, что понимание целостности организмов, к которым можно отнести и растения, возможно на пути интегратизма отдельных направлений познания природы. Физиология растений

вэтом отношении, как отмечал А. Л. Курсанов (1997), устраняет односторонность интересов отдельных наук – молекулярной биологии, генетики, протеомики, метаболики и других возникающих разделов биологии.

На ранних этапах своего развития физиология растений включала такие дисциплины, как анатомия, микробиология, вирусология, биохимия. Именно благодаря совершенствованию методов физиологических исследований были совершены удивительные открытия по каждому из этих направлений физиологии растений. В частности, начатое А. Р. Кизелем изучение нуклеиновых кислот растений способствовало оформлению новых дисциплин – биохимии растений, молекулярной биологии, у истоков которых вместе с учителем был и его выдающийся ученик А. Н. Белозерский (Курсанова, 2004).

По мнению А. Л. Курсанова (1997), физиология растений должна занимать особенно активную позицию, так как предмет ее исследований – автотрофные организмы, определяющие формирование биосферы нашей планеты. В этом сейчас состоят специфика, тенденция и перспектива развития будущих исследований.

2.1.Методика определения морфогенетического индекса продуктивности (МИП) сорта пшеницы

Постоянно возобновляемым источником энергии на Земле являются растения. Свойственный им фототрофный тип питания (фотосинтез) есть обязательное, но не достаточное звено аккумуляции энергии, определяемой как продукционный процесс. Понимание данной аксиомы произошло постепенно – от признания за фотосинтезом главенствующей роли в соз-

19

дании биомассы растений (Тимирязев, 1937) до статуса фотосинтеза как элемента в единой цепи аккумуляции энергии на уровне целого растения (Любименко, 1921; Ничипорович, 1980). В настоящее время получило признание суждение (Мокроносов, 1981, 1983), что фотосинтетическое возрастание биомассы растения возможно на основе постоянно идущих явлений формообразования на разных уровнях его организации.

Как известно, попытки оценить влияние процессов роста, морфогенеза на урожай сельскохозяйственных культур предпринимались уже в начале селекции. Н. А. Максимов (1939) отмечал, что подавление ростовых процессов является основной причиной снижения урожаев при засухе. Именно меристематические ткани как эффекторные элементы системы регуляции целостности растения (Степанов, 2009) первыми испытывают влияние засухи.

Неоднократно предпринимались попытки разработать информативные лабораторные и полевые методы оценки влияния высокой температуры и засухи на рост и развитие, формирование элементов продуктивности растений. Здесь важно было соблюсти дилемму между фундаментальностью разрабатываемых методов и их практическим приложением для решения задач селекции. Желательно при этом, чтобы методы оценки стрессоустойчивости и продуктивности линий, сортов были простыми в исполнении и учитывали особенности растения как формы жизни, когда уникальную роль играет развитие транспортной системы и донорноакцепторных отношений между его органами (Гамалей, 1997, 1998).

Сотрудниками лаборатории физиологии растений НИИСХ Юго-Вос- тока на основании особенностей накопления и распределения сухой массы растений в период вегетации был разработан способ ранжирования генотипов яровой пшеницы по их потенциальной продуктивности и устойчивости к неблагоприятным факторам среды (Кумаков и др., 2000, 2001). В частности, было показано, что интегративным критерием сбалансированности морфогенетических процессов в неблагоприятных условиях произрастания растений является коэффициент реализации колоса (KРК), который рассчитывался по формуле

KРК = M2/M1,

где M1 – масса колоса в фазе цветения, г, M2 – масса колоса в фазе полной спелости зерна, г.

Этот показатель был выбран на том основании, что в течение периода цветение – спелость зерна основными растущими частями растения являются развивающиеся зерновки и на какую бы сферу жизнедеятельности растения ни оказывала влияние засуха, в конечном счете это отразится на процессах формирования и роста зерновок (Андреева и др., 1991).

20