Морфология и метаболизм микроорганизмов. Лабораторный практикум
.pdf
Среди свободноживущих азотфиксирующих бактерий наибольший интерес представляют виды родов Clostridium и Azotobacter.
С. pasteurianum – это анаэробная бактерия, вызывающая маслянокислое брожение, она имеет палочковидные клетки длиной 1,5–8 мкм и шириной 0,8–1,3 мкм. Молодые клетки несут перитрихально расположенные жгутики, в старых культурах образуются споры. При спорообразовании клетки утолщаются посередине или на конце [4] (рис. 4) [10]. В присутствии кислорода воздуха С. pasteurianum может развиваться только при наличии в среде аэробных бактерий, поглощающих кислород; организм малочувствителен к реакции среды и встречается как в кислых (рН 4,5–5,5), так и в щелочных (рН 8–9) почвах [4].
Рис. 4. Clostridium pasteurianum
Источником азотного питания для бактерий рода Clostridium могут служить соли аммония, азотной кислоты и многие содержащие азот органические соединения. При отсутствии указанных соединений бактерии усваивают молекулярный азот. Источником углерода для С. pasteurianum может быть широкий набор углеродсодержащих соединений – моносахариды, дисахариды, некоторые полисахариды (декстрин, крахмал) и органические кислоты. Развиваясь на питательных средах, содержащих углеводы, С. pasteurianum разлагает их с образованием масляной и уксусной кислот, диоксида углерода и водорода. Освобождающаяся при сбраживании углеводов энергия частично идет на усвоение молекулярного азота атмосферы [4].
Энергию для всех процессов жизнедеятельности, в том числе и ассимиляции атмосферного азота, бактерии вида С. pasteurianum получают за счет маслянокислого брожения. Сбраживают они моно- и дисахара и некоторые полисахариды. Клетки С. pasteurianum накапливают запасное питательное вещество – гранулезу (полисахарид,
31
близкий к крахмалу), которая окрашивается при воздействии раствора Люголя в сине-фиолетовый цвет. В период образования спор гранулеза постепенно исчезает [10].
С. pasteurianum считается слабоактивным фиксатором азота. Пределом его активности было связывание 1–3 мг азота на 1 г сброженного сахара. Однако, используя питательные среды, наиболее отвечающие физиологическим потребностям С. pasteurianum, его активность можно повысить до 10–12 мг азота на 1 г сброженного сахара, в некоторых случаях и более [4].
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Познакомиться со свободноживущими азотфиксирующими бактериями; получить накопительную культуру свободноживущих азотфиксирующих бактерий; приготовить и изучить прижизненный препарат накопительной культуры свободноживущих азотфиксирующих бактерий; провести качественные реакции на продукты жизнедеятельности свободноживущих азотфиксирующих бактерий.
АППАРАТУРА, ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ
Термостат; холодильник; микроскоп; кристаллизатор со стеклянным мостиком; спиртовка; штатив для пробирок; держатель для пробирки; чайная ложка; промывалка; емкость с дезинфицирующим раствором (6 % раствор пероксида водорода).
Две конические колбы на 100–150 мл или высокие пробирки, содержащие 2/3 объема элективной среды Виноградского или среды Емцева, закрытые каучуковыми пробками.
Почва; стерильная пипетка объемом 1 мл; три пипетки объемом 1 мл, пипетка объемом 5 мл; две высокие пробирки.
Спички; хлопчатобумажная ткань или вата для очистки объектива микроскопа от остатков иммерсионного масла; набор для приготовления препаратов (предметные стекла, кусочек сухого мыла, хлопчатобумажная ткань для протирания стекол, полоски фильтровальной бумаги); покровные стекла.
32
Водный фуксин; спиртоэфирная смесь; иммерсионное масло; дистиллированная вода для промывания препарата; раствор Люголя, 5%-ный раствор хлорида железа; 96%-ный этиловый спирт; концентрированная серная кислота [7].
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ
Получение накопительной культуры свободноживущих азотфиксирующих бактерий
1.В две колбы или высокие пробирки с питательной средой внести по 1/3 чайной ложки почвы.
2.Колбы с посевами инкубировать в термостате при температуре 25–30 °С в течение пяти суток, затем убрать в холодильник до следующего занятия.
3.Через несколько дней отметить помутнение среды и обильное образование газов.
4.По окончании инкубирования содержимое колб проанализировать для обнаружения свободноживущих азотфиксирующих бактерий
иопределения продуктов их жизнедеятельности путем приготовления и изучения прижизненного препарата и проведения качественных реакций.
Приготовление прижизненного препарата («Раздавленная капля») свободноживущих азотфиксирующих бактерий
1.Подготовить предметное стекло и поместить его на стеклянный мостик над кристаллизатором.
2.Содержимое колбы или высокой пробирки с выращенной культурой микроорганизмов хорошо размешать, чтобы микроорганизмы, осевшие на дно колбы, равномерно распределились по всему объему питательной среды. В течение 15–20 с дать осесть грубым частицам.
3.Стерильной пипеткой из середины питательной среды взять каплю культуральной жидкости и перенести ее на подготовленное предметное стекло не размазывая.
33
4.К капле культуральной жидкости на предметном стекле добавить каплю раствора Люголя.
5.Покровное стекло поместить на каплю накопительной культуры микроорганизмов на предметном стекле так, чтобы не образовалось пузырьков воздуха. При необходимости удалить излишки жидкости полоской фильтровальной бумаги [7].
Изучение прижизненного препарата («Раздавленная капля») свободноживущих азотфиксирующих бактерий
1.Промикроскопировать препарат (объектив 100×, окуляр 10×). Просмотреть несколько полей зрения. Найти на препарате свободноживущие азотфиксирующие бактерии (см. рис. 4).
2.Обратить внимание на форму клеток, особенности их внутреннего строения и расположения относительно друг друга. Клетки С. pasteurianum, содержащие гранулезу, приобретают синефиолетовую окраску. Как правило, преобладают веретенообразные формы.
3.Записать в тетради название препарата, окраску и увеличение. Зарисовать несколько клеток свободноживущих азотфиксирующих бактерий.
4.Обозначить на рисунке свободноживущие азотфиксирующие бактерии.
Проведение качественных реакций на масляную кислоту
1. Получение маслянокислого железа – реакция с FeCl3. Нейтральные растворы маслянокислых солей при нагревании с FeCl3 приобретают коричневое окрашивание вследствие образования маслянокислого железа. В пробирку наливают 3–5 мл культуральной жидкости, добавляют 1–2 мл 5%-ного раствора хлорида железа и нагревают на пламени. Реакция идет по уравнению
3Са(СН3СН2СН2СОО)2 + 2FeCl3 = 2Fе(СН3СН2СН2СОО)3 + 3СаСl2
Раствор маслянокислого железа в отраженном свете приобретает буровато-коричневое окрашивание, а в проходящем свете – кровавокрасное [10].
34
2. При получении этилового эфира масляной кислоты – ананасовой эссенции – в пробирку к 3–5 мл культуральной жидкости прибавляют 0,5 мл 96%-ного этилового спирта и 1–2 мл концентрированной серной кислоты.
Реакция протекает по уравнению
Са(СН3СН2СН2СОО)2 + 2СН3СН2ОН = = 2СН3СН2СН2СООСН2СН3 + СаОН
При взбалтывании и нагревании появляется характерный запах эфира (аромат ананаса) [10].
ПОЛУЧАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
Прижизненный препарат («Раздавленная капля») свободноживущих азотфиксирующих бактерий.
Окраска: раствор Люголя.
Увеличение: 400×.
СОДЕРЖАНИЕ ОТЧЕТА
Содержание отчета по лабораторной работе приведено в приложении.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1.Что такое азотфиксация?
2.Какие разновидности азотфиксации вы знаете?
3.Какой ферментный комплекс участвует в фиксации молекулярного азота? Каковы его особенности?
4.Какие микроорганизмы способны проводить фиксацию молекулярного азота?
5.Какие свободноживущие микроорганизмы способны проводить фиксацию молекулярного азота?
6.Какие продукты образуются в результате жизнедеятельности свободноживущих азотфиксирующих бактерий вида Clostridium pasteurianum?
7.Какие качественные реакции выявления масляной кислоты вы знаете? Как их провести?
35
Лабораторная работа № 5
ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫЗЫВАЮЩИХ БРОЖЕНИЕ И ОКИСЛЕНИЕ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ
Путем брожения целлюлоза разрушается в анаэробных условиях под влиянием различных спорообразующих бактерий, распространенных в почве, навозе, неразлагающихся растительных тканях, в рубце жвачных животных. Упрощенно этот процесс может быть представлен в виде следующей схемы.
Первый этап – гидролиз целлюлозы и образование дисахаридов (целлобиозы) и моносахаридов (глюкозы):
(С6Н10О5)n + Н2О → nС12Н22О11 nС12Н22О11 + Н2О → nС6Н12О6
Второй этап – сбраживание моносахаридов (глюкозы):
С6Н12О6 → СН3СН2СН2СООН + СН3СООН + СН3СН2ОН +
+СН3СНОНСООН + НСООН + СО2 + Н2
Внакопительной культуре мезофильных бактерий, вызывающих брожение целлюлозы, развиваются длинные тонкие палочки с круг-
лой спорой на конце – Clostridium omelianskii (рис. 5) [10].
Окисление целлюлозы наиболее широко распространено в природе, так как целлюлоза составляет подавляющую часть растительных остатков. В хорошо аэрируемой почве это окисление выполняют аэробные микроорганизмы (бактерии, грибы и актиномицеты). Они вырабатывают ферменты целлюлозу и целлобиазу, вызывающие гидролиз целлюлозы до глюкозы, которую затем окисляют до СО2 и Н2О; промежуточными продуктами служат оксикислоты:
nC6H12O6 + XO2 → R – CHOHCOOH + CO2 + H2O + Q R – CHOHCOOH + XO2 → CO2 + H2O + Q
Наиболее часто окисление целлюлозы вызывают микроорганизмы, представленные на рис. 6 [10].
36
а |
б |
в |
Рис. 5. Clostridium omelianskii:
a – молодые клетки; б – клетки со спорами; в – споры
Cytophаgа (рис. 6, а) – бактерии со сложным циклом развития. Клетки – слегка извитые, довольно длинные (3–8 мкм) палочки с заостренными концами, при старении они переходят в укороченные палочки с округлыми концами, а могут перейти и в шаровидную форму – миксоспоры или микроцисты, покрытые с поверхности слизью (покоящееся состояние) [9]. Грамотрицательные. Облигатные или факультативные анаэробы. Оптимальная температура для их развития составляет 20–35 °С, оптимальный рН около 7. Распространены в почве, разлагающемся органическом веществе, пресноводных водоемах, морях и океанах [9]. Разные виды этого рода образуют на целлюлозе колонии в виде желтых, розовых и коричневых пятен, иногда бесцветные [10].
Cellovibrio (в настоящее время их описывают как Pseudomonas fluorescens var. cellulosa) – мелкие, слегка изогнутые в виде полумесяца, неспорообразующие палочки с закругленными концами, длина их 3–4 мкм, ширина 0,4–0,5 мкм (рис. 6, б). По поверхности фильтровальной бумаги они распространяются очень быстро и окрашивают ее в охряно-желтый цвет [9, 10].
Cellfalcicula – палочковидные клетки, утолщенные в центре, с заостренными концами (рис. 6, в). Образуют на целлюлозе слизистые зеленые колонии, пигмент легко диффундирует в среду и окрашивает гель в зеленый цвет.
Polyangium (рис. 6, г) и Sorangium (рис. 6, д). Клетки этих двух родов – палочковидные, при старении укорачиваются и образуют микроцисты, которые собраны по 12–40 клеток в цисту. Из них форми-
37
руются плодовые тела. Плодовые тела Polyangium luteum показаны на рис. 6, е. На целлюлозе эти микроорганизмы образуют колонии в виде слизистого налета желтого, оранжевого или темно-коричневого цвета.
а |
б |
в |
г |
д |
е |
Рис. 6. Бактерии, окисляющие целлюлозу:
а– Cytophaga; б – Cellovibrio; в – Cellfalcicula; г – Polyangium;
д– Sorangium; е – плодовые тепа бактерий рода Polyangium
Из грибов, разрушающих целлюлозу, часто можно обнаружить представителей нескольких родов, большинство из них представлены на рис. 7 [10].
а |
б |
в |
г |
Рис. 7. Грибы, разрушающие целлюлозу:
а– Dematium: б – Stachybotrys; в – Cladosporium;
г– хламидоспоры эпифитного гриба Fumago на целлюлозе
38
Dematium – образуют одноклеточные бесцветные конидии округлой или овальной формы. Вегетативные клетки темные, цилиндрические, собраны в цепочки (рис. 7, а). Колонии на целлюлозе имеют вид черных пятен.
Stachybotrys – колонии черные, бархатистые, под микроскопом обнаруживаются спорангии, покрытые темноокрашенными спорами
(рис. 7, б).
Cladosporium – конидиеносцы длинные, многоклеточные, от них отпочковываются неправильной формы конидии (рис. 7, в). Колонии окрашены в светлый оливково-зеленый цвет.
Fumago – колонии на целлюлозе темные и состоят из скоплений узелков темных овальных и округлых хламидоспор (рис. 7, г).
Chaetomium – образуют перитеции серого или зеленоватого цвета; аспорогенные грибы – образуют желтый или белый мицелий без спороношения.
Активное участие в разложении клетчатки принимают некоторые актиномицеты – Actinomyces violaceus, A. cellulosae и Micromonospora chalceae.
Миксобактерии рода Sorangium легко обнаружить в подзолистых почвах под луговой растительностью и на окультуренных почвах. В этих же почвах при благоприятном режиме можно выявить и бактерии рода Cellvibrio, а на унавоженных – Cytophaga. В степных почвах наряду с грибами встречаются бактерии рода Polyangium [10].
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Познакомиться с микроорганизмами, вызывающими брожение целлюлозы; получить накопительные культуры мезофильных микроорганизмов, вызывающих брожение целлюлозы; приготовить и изучить постоянные препараты мезофильных микроорганизмов, вызывающих брожение целлюлозы.
Познакомиться с микроорганизмами, вызывающими окисление целлюлозы; получить накопительную культуру микроорганизмов,
39
вызывающих окисление целлюлозы; приготовить и изучить постоянный препарат микроорганизмов, вызывающих окисление целлюлозы.
АППАРАТУРА, ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ
Два термостата; микроскоп; кристаллизатор со стеклянным мостиком; спиртовка; штатив для пробирок; пинцет; чайная ложка; промывалка; емкость с дезинфицирующим раствором (6%-ный раствор пероксида водорода).
Круглая плоскодонная колба на 100 мл, содержащая питательную среду для получения накопительной культуры мезофильных микроорганизмов, вызывающих брожение целлюлозы, закрытая ватной пробкой.
Круглая плоскодонная колба на 100 мл, содержащая питательную среду Омелянского для получения накопительной культуры микроорганизмов, вызывающих окисление целлюлозы, закрытая ватной пробкой.
Спички; хлопчатобумажная ткань или вата для очистки объектива микроскопа от остатков иммерсионного масла; набор для приготовления препаратов (предметные стекла, кусочек сухого мыла, хлопчатобумажная ткань для протирания стекол, полоски фильтровальной бумаги); два стерильных складчатых фильтра; стерильные корковые пробки для круглой плоскодонной колбы с отверстиями для выхода газов.
Почва; водный фуксин; спиртоэфирная смесь; иммерсионное масло; дистиллированная вода для промывания препарата [7].
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ
Получение накопительной культуры мезофильных микроорганизмов, вызывающих брожение целлюлозы
1. В круглую плоскодонную колбу с питательной средой для получения накопительной культуры мезофильных микроорганизмов, вызывающих брожение целлюлозы, внести 1/4 чайной ложки почвы и закрыть колбу корковой пробкой с отверстием для выхода газов.
40