Морфология и метаболизм микроорганизмов. Лабораторный практикум

Проведение качественных реакций на продукты гнилостного распада белков

1.Накопление аммиака в атмосфере обнаруживают по изменению цвета подвешенной в колбе красной лакмусовой бумажки. Если

впроцессе инкубирования накопительной культуры микроорганизмов, вызывающих аммонификацию белковых веществ, ее красный цвет меняется на синий, то в атмосфере присутствует аммиак [10].

2.Накопление аммиака в субстрате устанавливают при помощи реактива Несслера. Реакция капельная. В фарфоровые чашки помещают каплю реактива Несслера, затем стерильной бактериологической петлей добавляют каплю полученной накопительной культуры микроорганизмов, вызывающих аммонификацию белковых веществ. При большом количестве аммиака образуется коричневый или буроватый осадок, при небольшом появляется оранжевая или желтая окраска [9].

3.Сероводород обнаруживают при помощи подвешенной фильтровальной бумажки, смоченной ацетатом свинца. Бумажка чернеет под действием сероводорода. Если она покрывается серебристым налетом, следовательно, наряду с сероводородом, выделяются и меркаптаны (например, метилмеркаптан CH3SH) [10].

4.Индол обнаруживают при помощи подвешенной фильтровальной бумажки, смоченной насыщенным водным раствором щавелевой кислоты (индикаторной бумаги на индол по Морелю). При образовании развивающимися микроорганизмами индола нижний конец индикаторной бумаги, подвешенной в пробирку или колбу, приобретает сиреневый или малиновый цвет различной интенсивности [6].

5.Для проведения реакции Сальковского, выявляющей индол, в фарфоровую чашку пипеткой вносят 10 мл накопительной культуры микроорганизмов, вызывающих аммонификацию белковых веществ, добавляют 1 мл 0,2%-ного нитрита калия и несколько капель концентрированной серной кислоты. При взаимодействии этих веществ с индолом получается красно-фиолетовое окрашивание [10].

11

6. Для проведения реакции с реактивом Эрлиха, выявляющей индол, в фарфоровую чашку пипеткой вносят 10 мл накопительной культуры микроорганизмов, вызывающих аммонификацию белковых веществ, пипеткой добавляют 5 мл реактива Эрлиха, содержащего парадиметиламидобензальдегид, и 5 мл насыщенного раствора сульфата калия. При наличии индола возникает интенсивное красное окрашивание [10].

ПОЛУЧАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Прижизненный препарат («Раздавленная капля») микроорганизмов, вызывающих аммонификацию белковых веществ.

Увеличение: 400×.

Постоянный препарат микроорганизмов, вызывающих аммонификацию белковых веществ.

Окраска: водный фуксин.

Увеличение: 1000×.

СОДЕРЖАНИЕ ОТЧЕТА

Содержание отчета по лабораторной работе приведено в приложении.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Что такое аммонификация белковых веществ?

2.Какие микроорганизмы способны вызывать аммонификацию белковых веществ?

3.Какие ферменты участвуют в процессе аммонификации белковых веществ?

4.Какие продукты образуются в результате аммонификации белковых веществ микроорганизмами в аэробных условиях?

5.Какие продукты образуются в результате аммонификации белковых веществ микроорганизмами в анаэробных условиях?

6.Каковы морфологические особенности бактерий вида Bacillus mycoides?

12

7.Каковы морфологические особенности бактерий вида Proteus vulgaris?

8.Каковы морфологические особенности бактерий вида Clostridium putrificus?

9.Какие качественные реакции выявления наличия аммиака в атмосфере над культуральной жидкостью и в самой культуральной жидкости вы знаете? Как их провести?

10.Какую качественную реакцию выявления наличия сероводорода в атмосфере над культуральной жидкостью вы знаете? Как ее провести?

11.Какую качественную реакцию выявления наличия индола в атмосфере над культуральной жидкостью вы знаете? Как ее провести?

12.Какие качественные реакции выявления наличия индола в культуральной жидкости вы знаете? Как их провести?

Лабораторная работа № 2

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫЗЫВАЮЩИХ АММОНИФИКАЦИЮ МОЧЕВИНЫ

Мочевина – конечный продукт превращения соединений азота в организме человека и животных, ее могут синтезировать почвенные грибы [4, 10].

Микроорганизмы, вызывающие аммонификацию мочевины, вырабатывают экзофермент уреазу, который в несколько этапов гидролизует мочевину до аммиака. Суммарное уравнение реакции [4, 10]

CO(NH2)2 + 2H2O = 2NH3 + CO2 + H2O

Многие бактерии и грибы, синтезирующие уреазу, могут использовать мочевину как источник азота для синтеза белков. Обычно бактерии, разлагающие мочевину, называют уробактериями [4]. Они были открыты Л. Пастером в 1862 г. Уробактерии являются аэробами [1]. Они могут хорошо развиваться только при высокой щелочности среды (рН 9–10) [4].

13

В качестве источников азота уробактерии используют аммиачные соли или аммиак, образующийся при гидролизе мочевины. Углерод, содержащийся в мочевине, уробактерии использовать не могут, так как он находится в сильно окисленной форме и при гидролизе не выделяется в виде диоксида углерода [1]. Источниками углерода служат некоторые углеводы (моносахариды, дисахариды, крахмал) и соли органических кислот (лимонной, яблочной, янтарной и других) [1, 10].

Среди уробактерий встречаются как палочки, так и кокки [1]. Наиболее важными представителями специфических уробактерий яв-

ляются палочки Bacillus probatus и Bacillus pasteurii (рис. 2) из се-

мейства Bacillaceae и кокки видов Micrococcus urea из семейства

Micrococcaceae, а также Sporosarcina urea [4].

Чаще всего аммонификацию мочевины вызывают бактерии вида

Bacillus pasteurii, реже – Sporosarcina urеае [10].

Рис. 2. Возбудители аммонификации мочевины –

Bacillus pasteurii

Физиологический смысл распада мочевины, по-видимому, заключается в переводе аминной формы азота в более легко усвояемую растениями аммиачную форму [1, 4].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Познакомиться с микроорганизмами, вызывающими аммонификацию мочевины; получить накопительную культуру микроорганизмов, вызывающих аммонификацию мочевины; приготовить и изучить постоянный препарат микроорганизмов, вызывающих аммонифика-

14

цию мочевины; провести качественные реакции на аммиак как продукт аммонификации мочевины.

АППАРАТУРА, ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

Термостат; холодильник; микроскоп; кристаллизатор со стеклянным мостиком; спиртовка; штатив для пробирок; бактериологическая петля; пинцет; чайная ложка; промывалка; емкость с дезинфицирующим раствором (6%-ный раствор пероксида водорода).

Две конические колбы на 100 мл, содержащие по 30 мл питательной среды для выделения микроорганизмов – аммонификаторов мочевины, закрытые ватными пробками.

Почва или навоз; полоска красной лакмусовой бумаги; полоска фильтровальной бумаги; фарфоровая чашка; пипетка объемом 1 мл; пипетка объемом 10 мл.

Спички; хлопчатобумажная ткань или вата для очистки объектива микроскопа от остатков иммерсионного масла; набор для приготовления препаратов (предметные стекла, кусочек сухого мыла, хлопчатобумажная ткань для протирания стекол, полоски фильтровальной бумаги); покровные стекла.

Водный фуксин; спиртоэфирная смесь; иммерсионное масло; дистиллированная вода для промывания препарата; реактив Несслера [7].

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

Получение накопительной культуры микроорганизмов, вызывающих аммонификацию мочевины

1.В две колбы с питательной средой внести по 1/3 чайной ложки почвы или навоза.

2.Над средой подвесить красную лакмусовую бумажку, смоченную дистиллированной водой, для обнаружения выделяющегося аммиака. Бумажка не должна касаться среды. Закрепить ее между проб-

15

кой и стенками горлышка колбы. Сверху горлышко колбы обернуть бумагой.

3.Колбы с посевами инкубировать в термостате при температуре 25–30 °С в течение трех-пяти суток, затем убрать в холодильник до следующего занятия.

4.По окончании инкубирования содержимое колб проанализировать для обнаружения возбудителей процесса аммонификации мочевины и определения аммиака как продукта жизнедеятельности микроорганизмов, образующегося при аммонификации мочевины, путем приготовления и изучения постоянного препарата и проведения качественных реакций.

Приготовление постоянного препарата микроорганизмов, вызывающих аммонификацию мочевины

1.Подготовить предметное стекло и поместить его на стеклянный мостик над кристаллизатором.

2.Зажечь спиртовку.

3.Простерилизованной и охлажденной прикосновением к внутренней поверхности колбы бактериологической петлей взять материал едва заметной пленки, образующейся на поверхности культураль-

ной жидкости, перенести его на подготовленное предметное стекло и равномерно размазать на площади 1–2 см2.

4.Простерилизовать бактериологическую петлю, поставить петлю в штатив и погасить спиртовку.

5.Мазок высушить на воздухе и зафиксировать над пламенем спиртовки.

6.Сверху на мазок положить полоску фильтровальной бумаги, налить раствор красителя (водного фуксина) и окрашивать 3 мин.

7.Фильтровальную бумагу снять пинцетом, препарат промывать струей дистиллированной воды до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной.

8.Препарат высушить на воздухе или осторожно промокнуть его фильтровальной бумагой [7].

16

Изучение постоянного препарата микроорганизмов, вызывающих аммонификацию мочевины

1.Промикроскопировать препарат (объектив 100×, окуляр 10×). Просмотреть несколько полей зрения. Найти на препарате микроорганизмы, вызывающие аммонификацию мочевины (см. рис. 2). Обратить внимание на форму клеток, особенности их внутреннего строения и расположения относительно друг друга.

2.Записать в тетради название препарата, окраску и увеличение. Зарисовать несколько клеток микроорганизмов, вызывающих аммонификацию мочевины.

3.Обозначить на рисунке клетки микроорганизмов, вызывающих аммонификацию мочевины.

Проведение качественных реакций на аммиак как продукт аммонификации мочевины

1.Накопление аммиака в атмосфере обнаруживают по изменению цвета подвешенной в колбе красной лакмусовой бумажки. Если

впроцессе инкубирования накопительной культуры микроорганизмов, вызывающих аммонификацию мочевины, ее красный цвет меняется на синий, то в атмосфере присутствует аммиак [9].

2.Накопление аммиака в субстрате устанавливают при помощи реактива Несслера. Реакция капельная. В фарфоровые чашки помещают каплю реактива Несслера, затем стерильной бактериологической петлей добавляют каплю полученной накопительной культуры микроорганизмов, вызывающих аммонификацию мочевины. При большом количестве аммиака образуется коричневый или буроватый осадок, при небольшом – появляется оранжевая или желтая окраска [9].

ПОЛУЧАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Постоянный препарат микроорганизмов, вызывающих аммонификацию мочевины.

Окраска: водный фуксин.

Увеличение: 1000×.

17

СОДЕРЖАНИЕ ОТЧЕТА

Содержание отчета по лабораторной работе приведено в приложении.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Что такое аммонификация мочевины?

2.Какой фермент участвует в процессе аммонификации мочевины?

3.Какие продукты образуются в результате аммонификации мочевины микроорганизмами?

4.Какие источники азота могут использовать уробактерии?

5.Какие источники углерода могут использовать уробактерии?

6.Какие группы микроорганизмов могут вызывать аммонификацию мочевины?

7.Каковы общие специфические признаки уробактерий?

8.Какие палочковидные бактерии способны вызывать аммонификацию мочевины?

9.Какие шаровидные бактерии способны вызывать аммонификацию мочевины?

10.Какие микроорганизмы чаще всего вызывают аммонификацию мочевины?

11.В чем заключается физиологический смысл распада мочевины под действием микроорганизмов?

12.Какие качественные реакции выявления наличия аммиака в атмосфере над культуральной жидкостью и в самой культуральной жидкости вы знаете? Как их провести?

Лабораторная работа № 3

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ НИТРИФИЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ

Продукты, образующиеся при аммонификации белков и разложении мочевины – аммиак и аммиачные соли – могут быть усвоены растениями, но обычно они превращаются в соли азотной кислоты – нитраты [1].

18

Под нитрификацией понимают процессы окисления аммиака до нитрита и нитрата [10]. В процессе нитрификации выделяют две фазы. В первой фазе нитрификации аммиак окисляется до азотистой кислоты:

Превращения аммиака в азотистую кислоту в первой фазе нитрификации происходят по следующей схеме [1]:

Во второй фазе азотистая кислота окисляется до азотной кислоты:

Первую и вторую фазы единого процесса нитрификации вызывают разные возбудители [1]. Энергию, выделяющуюся при окислении аммиака и нитрита, бактерии используют с целью ассимиляции диоксида углерода для синтеза органических веществ. Нитрифицирующие бактерии являются хемолитоавтотрофами, поэтому они очень чувствительны к присутствию в среде органических соединений. Наличие в питательной среде даже небольшого количества органических веществ тормозит рост и развитие нитрифицирующих бактерий, их культивируют на чисто минеральных средах.

Нитрифицирующие бактерии всех видов являются облигатными аэробами [9, 10], поэтому присутствие молекулярного кислорода стимулирует процесс нитрификации. Замечено, что в обрабатываемых почвах процесс нитрификации протекает более интенсивно [1]. Исключение составляют представители рода Nitrobacter, которые могут расти за счет анаэробного дыхания [9].

19

Интенсивность нитрификации характеризует агрономические свойства почвы. Однако нитраты легко выщелачиваются (вымываются) из почвы, что обедняет запас азота в почве. Для предотвращения потерь снижают интенсивность процесса нитрификации благодаря специфическим ингибиторам, подавляющим активность нитрифицирующих бактерий. В почве минеральный азот может потребляться микроорганизмами, включаясь в состав аминокислот, белков и других соединений. Этот процесс называется иммобилизацией азота, т.е. это процесс, обратный минерализации. Биологически закрепленный азот не теряется из почвы [3].

Представителей обеих групп возбудителей нитрификации относят к семейству Nitrobacteriaceae. Это одноклеточные грамотрицательные бактерии. Среди нитрифицирующих бактерий есть палочковидные клетки, эллиптические, сферические, извитые и дольчатые, плеоморфные. Размеры клеток колеблются от 0,3 до 1 мкм в ширину и от 1 до 3 мкм в длину. Существуют подвижные и неподвижные формы с полярным, субполярным и перитрихальным жгутикованием.

Размножаются бактерии-нитрификаторы в основном делением, за исключением Nitrobacter, для которого характерно почкование. Почти у всех нитрификаторов хорошо развита система внутрицитоплазматических мембран, значительно различающихся по форме и расположению в клетках отдельных видов.

Бактерии первой фазы нитрификации представлены родами:

Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus и Nitrosovibrio.

Они имеют палочковидные, сферические, спиральные или дольчатые клетки. Бактерии первой фазы нитрификации распространены в почвах, сточных водах, реках, озерах, океанах, солоноватой воде [9]. Наиболее детально к настоящему времени изучен вид Nitrosomonas europaea. Он представляет собой короткие овальные палочки размером 0,8–1 × × 1–2 мкм. В жидкой культуре клетки Nitrosomonas проходят ряд стадий развития. Две основные из них представлены подвижной формой и неподвижными зооглеями. Подвижная форма обладает субполярным

20