Морфология и метаболизм микроорганизмов. Лабораторный практикум

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «САМАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

К а ф е д р а «Технология пищевых производств и биотехнология»

Е.Ю. РУДЕНКО, В.В. БАХАРЕВ

МОРФОЛОГИЯ И МЕТАБОЛИЗМ МИКРООРГАНИЗМОВ

Лабораторный практикум

Самара Самарский государственный технический университет

2018

1

Печатается по решению ученого совета СамГТУ (протокол № 9 от 27.04.2018 г.).

УДК 579(076.5)

ББК 28.4я73 Р 83

Руденко Е.Ю.

Р 83 Морфология и метаболизм микроорганизмов: лабор. практ. /

Е.Ю. Руденко, В.В. Бахарев. – Самара: Самар. гос. техн. ун-т, 2018. – 51 с.

Рассмотрены микроорганизмы, вызывающие аммонификацию белковых веществ и мочевины, нитрифицирующие и свободноживущие азотфиксирующие бактерии, микроорганизмы, вызывающие брожение и окисление целлюлозы, микроорганизмы, вызывающие окисление жиров.

Предназначен для студентов, обучающихся по направлению подготовки 19.03.01 «Биотехнология». Может быть интересен для преподавателей, специа- листов-биотехнологов, научных работников и аспирантов.

УДК 579(076.5)

ББК 28.4я73

Р 83

Р е ц е н з е н т канд. хим. наук, доцент Г.С. Муковнина

© Е.Ю. Руденко, В.В. Бахарев, 2018 © Самарский государственный

технический университет, 2018

2

ВВЕДЕНИЕ

В лабораторном практикуме рассмотрены различные виды микроорганизмов, вызывающие аммонификацию белковых веществ и мочевины, нитрифицирующие и свободноживущие азотфиксирующие бактерии, микроорганизмы, вызывающие брожение и окисление целлюлозы, микроорганизмы, вызывающие окисление жиров.

Данный практикум предназначен для студентов факультета пищевых производств, обучающихся по направлению подготовки 19.03.01 «Биотехнология», и выполнен в соответствии с требованиями образовательного стандарта для данного направления.

Практикум включает шесть лабораторных работ по основным разделам курса «Морфология и метаболизм микроорганизмов». Каждая лабораторная работа содержит краткие теоретические сведения, экспериментальную часть и контрольные вопросы.

3

Лабораторная работа № 1

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫЗЫВАЮЩИХ АММОНИФИКАЦИЮ БЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВ

В клетках живых организмов содержится большое количество белков, составляющих до 50 % сухой массы клеток. Значительная часть белков с остатками отмерших растений, животных и микроорганизмов попадает в почву и разлагается там. При разложении белков и других азотсодержащих органических соединений происходит выделение азота в виде аммиака, отчего процесс получил название аммонификации, или гниения [1, 4].

Аммонификация – это превращение органических форм азота в аммиачный азот [9]. Аммонификацию также называют минерализацией азота [3]. Аммонификация белковых веществ протекает как в аэробных, так и в анаэробных условиях при температуре не ниже 10 °С и определенной влажности, достаточной для нормальной жизнедеятельности микроорганизмов, осуществляющих данный процесс [1].

Способностью к разложению белков обладают бактерии, актиномицеты и мицелиальные грибы. Наибольшую активность при аммонификации белков проявляют различные бактерии, особенно активны

(В. mycoides, В. cereus, В. subtilis) и рода Clostridium (С. sporogenes,

С. putrificus), семейства Enterobacteriaceae, рода Proteus (P. vulgaris)

и др. [3]. Аммонифицирующая способность актиномицетов и грибов обычно ниже, чем у бактерий, и выражена в разной степени [1].

Молекулы белков и большинства пептидов велики и не могут проходить через цитоплазматическую мембрану микроорганизмов. Поэтому они расщепляются экзоферментами. Протеолитические ферменты, или протеазы, выделяемые клетками микроорганизмов в окружающую среду, осуществляют гидролиз ряда пептидных связей в молекулах

4

белков. Образующиеся при этом частицы белковой молекулы (полипептиды и олигопептиды) поступают внутрь клеток микроорганизмов, где разрушаются внутриклеточными протеолитическими ферментами – пептидазами до свободных аминокислот. Свободные аминокислоты используются для синтеза белков клетки или подвергаются дальнейшему расщеплению [4], т.е. дезаминируются с образованием аммиака, органических кислот и других продуктов [10].

Аминокислоты минерализуются с различной скоростью. Одни аминокислоты, например аргинин и триптофан, разлагаются легко, другие аминокислоты, например треонин и метионин, более устойчивы к минерализации [4].

При аэробном распаде белка основными конечными продуктами процесса бывают углекислый газ, аммиак, сульфаты и вода. В анаэробных условиях при распаде белка образуются аммиак, амины, СО2, органические кислоты (жирные и ароматические – бензойная, ферулиновая и др.), меркаптаны [3, 4], а также вещества с неприятным запахом – индол, скатол и сероводород [3, 4, 10].

При анаэробном разрушении белков могут образовываться токсичные соединения, в частности первичные амины (диамины) или птомаины. К числу последних относят кадаверин, который получается из лизина:

NH2(CH2)3CHNH2COOH → NH2CH2(CH2)3CH2NH2 + CO2

Продукты разложения белков, накапливающиеся в почве в анаэробных условиях, обладают фитотоксичностью, поэтому они нередко угнетают рост и развитие растений и снижают урожайность [4].

Аммонификацию белковых веществ чаще других вызывают Proteus vulgaris (рис. 1, б), преобладающие на первых стадиях распада белков [10]. Протеи – это прямые, неспорообразующие, подвижные (перитрихи) плеоморфные палочки неодинаковой длины, факультативные анаэробы. Большинство штаммов способно к роению с периодическими циклами миграции, приводящей к образованию кон-

5

центрических зон или распространению в виде однородной пленки по влажной поверхности плотной питательной среды [9]. Протеи обитают в кишечнике человека и животных, в навозе, почве и загрязненных водах [10].

Рис. 1. Возбудители аммонификации белковых веществ:

а – Bacillus mycoides; б – Proteus vulgaris; в – Clostridium putrificus

Кроме того, в аммонификации белков активно участвуют Bacillus mycoides (рис. 1, а) и Clostridium putrificus (рис. 1, в) [10].

Васillus mycoides представляют собой грамположительные подвижные (перитрихи), спорообразующие прямые палочки с закругленными или «обрубленными» концами, которые часто образуют пары или цепочки. Эндоспоры овальные, в клетке образуется не более одной споры [8]. Обитают повсеместно, широко распространены в почве [1, 8]. На плотной питательной среде рост колоний напоминает мицелий, поэтому Васillus mycoides называют корневидными или грибовидными бациллами [1]. Васillus mycoides вызывают аммонификацию белковых веществ в аэробных условиях [10].

Clostridium putrificus – это небольшие грамположительные споровые палочки, имеющие плектридиальный тип спорообразования, т.е. эндоспора в них расположена терминально (ближе к полюсу клетки) и диаметр ее шире клетки, поэтому клетка имеет вид барабанной палочки [1, 9]. Clostridium putrificus вызывают аммонификацию белковых веществ в анаэробных условиях [10]. Они широко распространены в природных средах [9], являются одними из наиболее

6

широко распространенных возбудителей анаэробного разложения белков и целлюлозы, образуют большое количество газов [1].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Познакомиться с микроорганизмами, вызывающими аммонификацию белковых веществ; получить накопительную культуру микроорганизмов, вызывающих аммонификацию белковых веществ; приготовить и изучить прижизненный и постоянный препараты микроорганизмов, вызывающих аммонификацию белковых веществ; провести качественные реакции на продукты гнилостного распада белков.

АППАРАТУРА, ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

Термостат; холодильник; микроскоп; кристаллизатор со стеклянным мостиком; спиртовка; штатив для пробирок; бактериологическая петля; пинцет; чайная ложка; промывалка; емкость с дезинфицирующим раствором (6%-ный раствор пероксида водорода).

Две конические колбы на 100 мл, содержащие по 30 мл питательной среды (мясного бульона с добавлением 3 % пептона), закрытые ватными пробками.

Почва; полоска красной лакмусовой бумаги; полоска фильтровальной бумаги, пропитанная раствором ацетата свинца; полоска фильтровальной бумаги, смоченная насыщенным водным раствором щавелевой кислоты; фарфоровая чашка; пипетка объемом 1 мл; пипетка объемом 10 мл.

Спички; хлопчатобумажная ткань или вата для очистки объектива микроскопа от остатков иммерсионного масла; набор для приготовления препаратов (предметные стекла, кусочек сухого мыла, хлопчатобумажная ткань для протирания стекол, полоски фильтровальной бумаги); покровные стекла.

Водный фуксин; спиртоэфирная смесь; иммерсионное масло; дистиллированная вода для промывания препарата; реактив Нессле-

7

ра; 0,2%-ный раствор нитрита калия; концентрированная серная кислота; реактив Эрлиха; насыщенный раствор сульфата калия [7].

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

Получение накопительной культуры микроорганизмов, вызывающих аммонификацию белковых веществ

1.В две колбы с питательной средой (мясной бульон с добавлением 3 % пептона) внести по 1/3 чайной ложки почвы.

2.Над средой подвесить две бумажки – красную лакмусовую, смоченную дистиллированной водой, для обнаружения выделяющегося аммиака и фильтровальную, смоченную щелочным раствором ацетата свинца для выявления сероводорода и меркаптана. Бумажки не должны касаться среды. Закрепить их между пробкой и стенками горлышка колбы. Сверху горлышко колбы обернуть бумагой.

3.Колбы с посевами инкубировать в термостате при температуре 28–30 °С в течение трех-пяти суток, затем убрать в холодильник до следующего занятия.

4.По окончании инкубирования содержимое колб проанализировать для обнаружения возбудителей процесса аммонификации белковых веществ и определения продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, образующихся при разложении белков путем приготовления и изучения прижизненного и постоянного препаратов и проведения качественных реакций.

Приготовление прижизненного препарата («Раздавленная капля») микроорганизмов, вызывающих аммонификацию белковых веществ

1.Подготовить предметное стекло и поместить его на стеклянный мостик над кристаллизатором.

2.Зажечь спиртовку.

3.Колбой с выращенной культурой микроорганизмов осторожно сделать несколько вращательных движений, чтобы микроорганизмы,

8

осевшие на дно колбы, равномерно распределились по всему объему питательной среды.

4.Простерилизованной и охлажденной прикосновением к внутренней поверхности колбы бактериологической петлей взять каплю культуральной жидкости и перенести ее на подготовленное предметное стекло, не размазывая.

5.Простерилизовать бактериологическую петлю, поставить петлю в штатив и погасить спиртовку.

6.Покровное стекло поместить на каплю накопительной культуры микроорганизмов на предметном стекле так, чтобы не образовалось пузырьков воздуха. При необходимости удалить излишки жидкости полоской фильтровальной бумаги [7].

Изучение прижизненного препарата («Раздавленная капля») микроорганизмов, вызывающих аммонификацию белковых веществ

1.Промикроскопировать препарат (объектив 40×, окуляр 10×). Просмотреть несколько полей зрения. Найти на препарате микроорганизмы, вызывающие аммонификацию белковых веществ (рис. 1). Обратить внимание на форму клеток, особенности их внутреннего строения и расположения относительно друг друга.

2.Записать в тетради название препарата, окраску и увеличение. Зарисовать несколько клеток микроорганизмов, вызывающих аммонификацию белковых веществ.

3.Обозначить на рисунке все обнаруженные роды микроорганизмов, вызывающих аммонификацию белковых веществ.

Приготовление постоянного препарата микроорганизмов, вызывающих аммонификацию белковых веществ

1.Подготовить предметное стекло и поместить его на стеклянный мостик над кристаллизатором.

2.Зажечь спиртовку.

9

3.Колбой с выращенной культурой микроорганизмов осторожно сделать несколько вращательных движений, чтобы микроорганизмы, осевшие на дно колбы, равномерно распределились по всему объему питательной среды.

4.Простерилизованной и охлажденной прикосновением к внутренней поверхности колбы бактериологической петлей взять культу-

ральную жидкость, перенести ее на подготовленное предметное стекло и равномерно размазать ее на площади 1–2 см2.

5.Простерилизовать бактериологическую петлю, поставить петлю в штатив и погасить спиртовку.

6.Мазок высушить на воздухе и зафиксировать над пламенем спиртовки.

7.Сверху на мазок положить полоску фильтровальной бумаги, налить раствор красителя (водного фуксина) и окрашивать 3 мин.

8.Фильтровальную бумагу снять пинцетом, препарат промывать струей дистиллированной воды до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной.

9.Препарат высушить на воздухе или осторожно промокнуть его фильтровальной бумагой [7].

Изучение постоянного препарата микроорганизмов, вызывающих аммонификацию белковых веществ

1. Промикроскопировать препарат (объектив 100×, окуляр 10×). Просмотреть несколько полей зрения. Найти на препарате микроорганизмы, вызывающие аммонификацию белковых веществ (см. рис. 1). Обратить внимание на форму клеток, особенности их внутреннего строения и расположения относительно друг друга.

2.Записать в тетради название препарата, окраску и увеличение. Зарисовать несколько клеток микроорганизмов, вызывающих аммонификацию белковых веществ.

3.Обозначить на рисунке все обнаруженные роды микроорганизмов, вызывающих аммонификацию белковых веществ.

10