Морфология и метаболизм микроорганизмов. Лабораторный практикум
.pdfжгутиком или пучком жгутиков. Описаны представители и других родов бактерий, вызывающих первую фазу нитрификации.
Вторую фазу нитрификации осуществляют представители родов
Nitrobacter, Nitrospina, Nitrococcus и Nitrospira [4, 9]. Они имеют клетки палочковидной, эллипсоидной, сферической или спиральной формы. Бактерии второй фазы нитрификации широко распространены в почвах, пресной, солоноватой и морской воде, в иловых отложениях, в системах очистки сточных вод, на поверхности кирпича, бетона, камней и горных пород [9]. Наибольшее число исследований проведено с Nitrobacter winogradskyi, однако описаны и другие виды бактерий, осуществляющих вторую фазу нитрификации (например, Nitrobacter agilis). Клетки нитробактера имеют удлиненную, клиновидную или грушевидную форму, более узкий конец часто загнут в клювик, размеры клеток – 0,6–0,8 × 1–2 мкм. При почковании дочерняя клетка обычно подвижна, так как имеет один полярный жгутик. Известно чередование в цикле развития подвижной и неподвижной стадий [4].
Нитрифицирующие бактерии культивируют на простых минеральных средах, содержащих аммиак или нитриты (окисляемые субстраты) и диоксид углерода (основной источник углерода). Источником азота для этих организмов служат аммиак, гидроксиламин и нитриты.
Нитрифицирующие бактерии развиваются при рН 5,8–8,6, оптимум реакции среды составляет рН 7,5–8,0. При значениях ниже рН 5,8 и выше рН 9,2 бактерии не развиваются. Оптимальная температура для развития нитрификаторов 28–30 °С. Изучение отношения различных штаммов Nitrosomonas europaea к температуре показало, что некоторые из них имеют оптимум развития при 26 °С или около 40 °С, другие способны довольно быстро расти при 4 °С [4, 9].
Раньше считали, что нитрификация – сугубо аэробный процесс. Оказалось, что этот процесс может происходить и в анаэробных условиях. Было замечено, что в анаэробных реакторах, осуществляющих очистку стоков от соединений азота, аммоний окисляется, но лишь в присутствии нитрита [5].
21
Возбудители первой фазы нитрификации имеют овальные клетки, похожие на ноль. К ним относятся бактерии родов Nitrosomonas (рис. 3) и Nitrosospira. Первые встречаются в старопахотных почвах, вторые – в целинных. В почвах Европы чаще встречаются
Nitrosomonas еurореа.
Рис. 3. Нитрифицирующие бактерии [11]:
1 – Nitrosomonas; 2 – Nitrobacter
Возбудителей второй фазы нитрификации – бактерии рода Nitrobacter имеют мелкие, слегка искривленные и угловатые клетки (см. рис. 3).
В связи с тем, что коэффициент полезного действия хемосинтеза у нитрифицирующих бактерий очень низкий, рост их клеточной массы незначителен, и на препаратах, приготовленных обычным способом, они не всегда обнаруживаются или обнаруживаются с трудом [10].
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Познакомиться с микроорганизмами, вызывающими нитрификацию; получить накопительные культуры микроорганизмов, вызывающих первую и вторую фазы нитрификации; приготовить и изучить постоянные препараты микроорганизмов, вызывающих первую и вторую фазы нитрификации; провести качественные реакции на продукты, образующиеся в первую и вторую фазы нитрификации.
22
АППАРАТУРА, ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ
Термостат; микроскоп; кристаллизатор со стеклянным мостиком; спиртовка; штатив для пробирок; бактериологическая петля; пробирка; пинцет; чайная ложка; держатель для пробирки; промывалка; емкость с дезинфицирующим раствором (6%-ный раствор пероксида водорода).
Две конические колбы на 100 мл, содержащие по 30 мл питательной среды для первой фазы нитрификации, закрытые ватными пробками.
Две конические колбы на 100 мл, содержащие по 30 мл питательной среды для второй фазы нитрификации, закрытые ватными пробками.
Почва; фарфоровая чашка; три глазных пипетки; две пипетки объемом 1 мл; пипетка объемом 10 мл.
Спички; хлопчатобумажная ткань или вата для очистки объектива микроскопа от остатков иммерсионного масла; набор для приготовления препаратов (предметные стекла, кусочек сухого мыла, хлопчатобумажная ткань для протирания стекол, полоски фильтровальной бумаги); фильтровальная бумага, предварительно пропитанная 1%-ным раствором крахмала.
Водный фуксин; спиртоэфирная смесь; иммерсионное масло; дистиллированная вода для промывания препарата; реактив Грисса (1%-ный раствор сульфаниловой кислоты в 30%-ном растворе уксусной кислоты и 0,1%-ный раствор α-нафтиламина в 30%-ном растворе уксусной кислоты); реактив Несслера; цинк-йод-крахмал; 20%-ный раствор серной кислоты; дифениламин кристаллический; 2 М раствор уксусной кислоты; 0,1 М раствор иодида калия; 1%-ный раствор перманганата калия [7].
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ
Получение накопительной культуры микроорганизмов, вызывающих первую фазу нитрификации
1.В две колбы с питательной средой для первой фазы нитрификации внести по 1/4 чайной ложки почвы.
2.Колбы с посевами инкубировать в термостате при температуре 25–30 °С в течение 14 суток.
23
3.По окончании инкубирования содержимое колб проанализировать для обнаружения аммиака и азотистой кислоты. В случае исчезновения аммиака опыт заканчивают, а при его наличии – продолжают инкубирование в течение еще 14 суток и снова проверяют наличие в среде аммиака.
4.После исчезновения в среде аммиака содержимое колб проанализировать для обнаружения возбудителей первой фазы нитрификации путем приготовления и изучения постоянного препарата и проведения качественных реакций.
Проведение качественной реакции для обнаружения аммиака
В фарфоровые чашки помещают каплю реактива Несслера, затем стерильной бактериологической петлей добавляют каплю полученной накопительной культуры микроорганизмов, вызывающих первую фазу нитрификации. При большом количестве аммиака образуется коричневый или буроватый осадок, при небольшом появляется оранжевая или желтая окраска [9].
Проведение качественных реакций для обнаружения азотистой кислоты
1. Реакция с реактивом Грисса в кислой среде. В пробирку пипетками налить по 1 мл растворов, составляющих реактив Грисса (1%-ного раствора сульфаниловой кислоты в 30%-ном растворе уксусной кислоты и 0,1%-ного раствора α-нафтиламина в 30%-ном растворе уксусной кислоты), и 10 мл исследуемой накопительной культуры микроорганизмов, вызывающих первую фазу нитрификации, и кипятить на спиртовке. В присутствии азотистой кислоты появляется красное окрашивание. Реактив очень чувствителен к HNO2 [10].
Ход реакции следующий:
H2N – C6H4SO3H + C10H7 – NH2 + NO2- →
Сульфаниловая α-Нафтиламин кислота
→ H2N – C6H6 – N = N – C6H4 – SO3H
Азокраситель красного цвета
24
2.Реакция с цинк-йод-крахмалом. В фарфоровую чашку пипеткой внести три капли реактива цинк-йод-крахмала, пипетками добавить каплю 20%-ного раствора серной кислоты и каплю исследуемой накопительной культуры микроорганизмов, вызывающих первую фазу нитрификации. В присутствии азотистой кислоты появляется тем- но-синее окрашивание [10].
3.Окисление иодидов. На фильтровальную бумагу, предварительно пропитанную 1%-ным раствором крахмала, последовательно нанести пипеткой по 1 капле 2 М раствора уксусной кислоты, исследуемой накопительной культуры микроорганизмов, вызывающих первую фазу нитрификации, и 0,1 М раствора иодида калия. В присутствии нитрит-ионов появляется синее пятно или кольцо. Реакции мешают другие окислители, окисляющие иодиды [2].
4.Реакция с перманганатом калия. В пробирку пипеткой внести 3–5 капель 1%-ного раствора перманганата калия, 2–3 капли 20%-ного раствора серной кислоты и нагреть смесь на спиртовке до 50–60 °С. Затем пипеткой добавить несколько капель накопительной культуры микроорганизмов, вызывающих первую фазу нитрификации. При этом раствор перманганата калия обесцвечивается, так как в
кислой среде происходит окисление нитрит-ионов до нитрат-ионов, a MnO4- переходит в Мn2+.
Следует придерживаться указанного порядка добавления реактивов, так как подкисленные растворы нитритов быстро разлагаются с выделением оксидов азота [2].
Приготовление постоянного препарата микроорганизмов, вызывающих первую фазу нитрификации
1.Подготовить предметное стекло и поместить его на стеклянный мостик над кристаллизатором.
2.Зажечь спиртовку.
3.Простерилизованной и охлажденной прикосновением к внутренней поверхности колбы бактериологической петлей взять материал едва заметной пленки, образующейся на поверхности культураль-
25
ной жидкости, перенести его на подготовленное предметное стекло и равномерно размазать на площади 1–2 см2.
4.Простерилизовать бактериологическую петлю, поставить петлю в штатив и погасить спиртовку.
5.Мазок высушить на воздухе и зафиксировать над пламенем спиртовки.
6.Сверху на мазок положить полоску фильтровальной бумаги, налить раствор красителя (водного фуксина) и окрашивать 3 мин.
7.Фильтровальную бумагу снять пинцетом, препарат промывать струей дистиллированной воды до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной.
8.Препарат высушить на воздухе или осторожно промокнуть его фильтровальной бумагой [7].
Изучение постоянного препарата микроорганизмов, вызывающих первую фазу нитрификации
1.Промикроскопировать препарат (объектив 100×, окуляр 10×). Просмотреть несколько полей зрения. Найти на препарате микроорганизмы, вызывающие первую фазу нитрификации (см. рис. 3). Обратить внимание на форму клеток, особенности их внутреннего строения и расположения относительно друг друга.
2.Записать в тетради название препарата, окраску и увеличение. Зарисовать несколько клеток микроорганизмов, вызывающих первую фазу нитрификации.
3.Обозначить на рисунке клетки микроорганизмов, вызывающих первую фазу нитрификации путем приготовления и изучения препарата и проведения качественных реакций.
Получение накопительной культуры микроорганизмов, вызывающих вторую фазу нитрификации
1. В две колбы с питательной средой для второй фазы нитрификации внести по 1/4 чайной ложки почвы.
26
2.Колбы с посевами инкубировать в термостате при температуре 25–30 °С в течение 14 суток.
3.По окончании инкубирования содержимое колб проанализировать для обнаружения азотной кислоты и азотистой кислоты. В случае исчезновения азотистой кислоты опыт заканчивают, а при ее наличии продолжают инкубирование в течение еще 14 суток и снова проверяют наличие в среде азотистой кислоты.
4.После исчезновения в среде азотистой кислоты содержимое колб проанализировать для обнаружения возбудителей второй фазы нитрификации путем приготовления и изучения постоянного препарата и проведения качественных реакций.
Проведение качественной реакции для обнаружения азотной кислоты
При исследовании второй фазы нитрификации после исчезновения нитрита вносят в фарфоровую чашку одну каплю 20%-ной H2SО4 и один кристалл дифениламина, затем добавляют каплю исследуемой накопительной культуры микроорганизмов, вызывающих вторую фазу нитрификации. Если в растворе содержится азотная кислота, то образуется темно-синее окрашивание; то же получается и при наличии азотистой кислоты. Поэтому пробу на нитраты с дифениламином используют при отсутствии нитрита [10].
Приготовление постоянного препарата микроорганизмов, вызывающих вторую фазу нитрификации
1.Подготовить предметное стекло и поместить его на стеклянный мостик над кристаллизатором.
2.Зажечь спиртовку.
3.Простерилизованной и охлажденной прикосновением к внутренней поверхности колбы бактериологической петлей взять материал едва заметной пленки, образующейся на поверхности культураль-
ной жидкости, перенести его на подготовленное предметное стекло и равномерно размазать на площади 1–2 см2.
27
4.Простерилизовать бактериологическую петлю, поставить петлю в штатив и погасить спиртовку.
5.Мазок высушить на воздухе и зафиксировать над пламенем спиртовки.
6.Сверху на мазок положить полоску фильтровальной бумаги, налить раствор красителя (водного фуксина) и окрашивать 3 мин.
7.Фильтровальную бумагу снять пинцетом, препарат промывать струей дистиллированной воды до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной.
8.Препарат высушить на воздухе или осторожно промокнуть его фильтровальной бумагой [7].
Изучение постоянного препарата микроорганизмов, вызывающих вторую фазу нитрификации
1.Промикроскопировать препарат (объектив 100×, окуляр 10×). Просмотреть несколько полей зрения. Найти на препарате микроорганизмы, вызывающие вторую фазу нитрификации (см. рис. 3). Обратить внимание на форму клеток, особенности их внутреннего строения и расположения относительно друг друга.
2.Записать в тетради название препарата, окраску и увеличение. Зарисовать несколько клеток микроорганизмов, вызывающих вторую фазу нитрификации.
3.Обозначить на рисунке клетки микроорганизмов, вызывающих вторую фазу нитрификации.
ПОЛУЧАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
Постоянный препарат микроорганизмов, вызывающих первую фазу нитрификации.
Окраска: водный фуксин.
Увеличение: 1000×.
Постоянный препарат микроорганизмов, вызывающих вторую фазу нитрификации.
Окраска: водный фуксин.
Увеличение: 1000×.
28
СОДЕРЖАНИЕ ОТЧЕТА
Содержание отчета по лабораторной работе приведено в приложении.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1.Что такое нитрификация?
2.Кем являются нитрифицирующие бактерии по отношению к молекулярному кислороду?
3.Что является субстратом для первой фазы нитрификации?
4.Какие продукты образуются в результате первой фазы нитрификации?
5.Какие микроорганизмы способны вызывать первую фазу нитрификации?
6.Каковы морфологические особенности микроорганизмов, способных вызывать первую фазу нитрификации? Где они обитают?
7.Каковы морфологические особенности бактерий рода
Nitrosomonas?
8.Что является субстратом для второй фазы нитрификации?
9.Какие продукты образуются в результате второй фазы нитрификации?
10.Какие микроорганизмы способны вызывать вторую фазу нитрификации?
11.Каковы морфологические особенности микроорганизмов, способных вызывать вторую фазу нитрификации? Где они обитают?
12.Каковы морфологические особенности бактерий рода
Nitrobacter?
13.Каковы физиолого-биохимические особенности нитрифицирующих бактерий?
14.Какую качественную реакцию для выявления наличия аммиака в культуральной жидкости вы знаете? Как ее провести?
15.Какие качественные реакции выявления наличия азотистой кислоты в культуральной жидкости вы знаете? Как их провести?
16.Какую качественную реакцию для выявления наличия азотной кислоты в культуральной жидкости вы знаете? Как ее провести?
29
Лабораторная работа № 4
ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СВОБОДНОЖИВУЩИХ АЗОТФИКСИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ
Газообразный азот химически инертен, он не может быть непосредственно использован растениями, животными и большинством микроорганизмов. Его запасы в атмосфере практически неисчерпаемы, однако, только специфическая группа микроорганизмов может связывать атмосферный азот – азотфиксирующие бактерии. Этот процесс называется азотфиксацией.
Азотфиксация в природе осуществляется свободноживущими (несимбиотическая азотфиксация) бактериями и бактериями, существующими в сообществе с растениями (симбиотическая азотфиксация) [3].
Ассимиляция атмосферного азота микроорганизмами имеет большое значение в общем балансе азота в почве. Особая роль в фиксации азота в почве принадлежит бактериям, которые усваивают элементарный азот атмосферы и таким образом обогащают почву связанным азотом [10].
Связывание азота – это восстановительный процесс, и первым его продуктом, который можно обнаружить, является аммиак. Процесс восстановления происходит на ферментном комплексе – нитрогеназе. Нитрогеназа состоит из двух компонентов: белка, в состав которого входят Mo, Fe и S, и белка, содержащего Fe и S. Их еще называют «компонент I» (или Мо-Fe-белок) и «компонент Н» (или Fe-S-белок). Фермент крайне чувствителен к молекулярному кислороду [3].
Большое число микроорганизмов – представители 80 родов из 27 семейств бактерий и по крайней мере три термофильных рода архей – обладают способностью к азотфиксации [5]. Способность к фиксации молекулярного азота присуща аноксигенным фототрофным бактериям, многим цианобактериям, факультативным анаэробам, хемолитоавтотрофным бактериям, метилотрофным, сульфатредуцирующим и метанообразующим бактериям. Особенно эффективно связывают азот атмосферы бактерии рода Azotobacter [3].
30