Молекулярная биология вируса Эбола. Учебное пособие

Несмотря на сложность строения полимеразного белка L вируса Эбола, его каталитическая активность поддерживается еще двумявируснымибелками–VP30иVP35,которыеучаствуютвре- гуляции транскрипции и репликации вирионной РНК [25]. VP30

вклетках подвергается гиперфосфорилированию по аминокислотным остаткам серина в последовательности RARSSSRENYRG

EYRQS42RS44AS46QVRVPTV. Фосфорилирование VP30 регулирует связывание с NP и негативно отражается на его транскрипционной активности. Усиление транскрипции белком VP30 зависит такжеотвзаимодействиясошпилькойвторичнойструктурыРНК, локализованной в положениях 54–80 н. лидерной области геномной РНК. Делеция этого элемента вторичной структуры приводит к независимому от белка VP30 синтезу вирусных мРНК [25]. На

N-конце VP30 локализуется Zn-фингер мотив типа Сys3-Нis. Исследование локализации РНК-связывающего домена по-

казало, что он располагается на N-конце, так как делеция участка 26–40 а. о. в VP30 приводит к нарушению связывания белка с РНК. Это свидетельствует о том, что функция связывания с РНК

вVP30 локализуется на узком участке N-концевого домена. VP30

вданном домене содержит два аминокислотных остатка тирозина в положениях 35 и 39, четыре аминокислотных остатка аргинина в положениях 28, 32, 36 и 40. Более того, структурный мотив RXRSXXS в пределах последовательности 27–33 а. о. VP30 вируса Эбола высококонсервативен для всех филовирусов.

2.5. Белок VP24

Мембранно-ассоциированный белок VP24 – второй антагонист интерферонов в составе протеома вируса Эбола [53, 64, 95, 96].

Мультифункциональный белок VP24 (рис. 24) является блокатором противовирусного статуса клеток, действующим на сигнальный путь активации транскрипции генов, кодирующих интерфероны I и II типов [53, 64, 95, 96]. Механизм действия VP24 уникален: его мишенью внутри инфицированных клеток является транскрипционный фактор [97]. В частности, VP24 блокирует

51

Рис. 24. Модели различных проекций белка VP24 вируса Эбола, напоминающего трехсторонние пирамиды [64]. Пирамидальная форма VP24 играет принципиальную роль в его взаимодействии с другими белками [53,64, 95, 96, 97]. Представлены три проекции,

стрелки обозначают локализацию консервативного кармана в проекциях 1 и 3

накопление фосфорилированной формы STAT1 в клеточном ядре посредством взаимодействия со STAT1-связывающим доменом транспортера ядерной поры кариоферина α5 (KPNA5) [53]. Таким образом, действие на клеточную противовирусную защиту белка VP24 реализуется в ядерной поре на уровне контроля транслокациитранскрипционныхфактороввклеточноеядро[14,64,59,97].

Кроме того, VP24 играет определенную роль в самосборке нуклеокапсида и почковании вирусных частиц (рис. 25). В этих процессах он выполняет функции минорного матриксного белка [95].

Метод масс-спектрометрии дейтериевого обмена (DXMS) позволяет быстро идентифицировать и осуществлять картирование сайтов белок-белковых взаимодействий. Преимущества метода DXMS по сравнению с сайт-направленным мутагенезом состоят не только в скорости и точности идентификации интерфейса бе- лок-белковых взаимодействий [64]. Метод позволяет сканировать потенциал взаимодействия амидных водородов к обмену с дейте-

52

а)

б)

Рис. 25. Модель третичной структуры комплекса VP24 (вирус Судан, фрагмент 1–233 а. о.) и клеточного регулятора транскрипции генов интерферонов I типа STAT1 [64]: а – пространственная модель фрагмента VP24; б – распределение последовательностей VP24 в сайтах связывания с клеточным белком STAT1 [14, 64, 97]

53

рием в растворе и выявлять участки транзиторного и устойчивого взаимодействия. В этом случае различаются атомы водорода с ограниченной подвижностью и с высокой конформационной мобильностью. Регистрация осуществляется по обмену Н/D. Метод DXMSбылиспользовандляизучениякомплексовбелкаVP24сбелкомSTAT1[64].УскоренныйобменH/Dустановлендляпоследовательностей 71–79 и 181–198 а. о. в VP24. Данные пептиды локализуются в α-спирали α3–4 и β-цепи β5–7 белка VP24, составляющих полярную полость в основании проекции 3 [64]. Эти домены высококонсервативны среди белков VP24 филовирусов. Медленный обмен Н/D установлен в коротких доменах 96–98 и 106–121 а. о., локализованныхвспиральныхучасткахα5иα6.Этипоследовательности также характеризуются высокой консервативностью [64].

Нарис.26представленаобщаясхемадействияVP24наключевой фактор активации транскрипции генов интерферонов. В нормальных условиях транслокация STAT1 в клеточное ядро зависит от его фосфорилирования тирозинкиназой. Фосфорилированная форма STAT1 взаимодействует с ядерным транспортером KPNA5. VP24 не способенсвязыватьсясклассическимсайтомNLS,чтообеспечивает избирательность эффекта без нарушения транспорта других необходимых для репродукции вируса транскрипционных факторов.

Таким образом, вирус Эбола обладает несколькими инструментами блокады противовирусной клеточной защиты. Уникальным свойством этого вируса является блокада транслокации сигнального фактора STAT1 в клеточное ядро. Вирусам Эбола, как и многим другим патогенным вирусам, свойственна индукция цитокинового шторма [58]. Уровень интерферонов и других провоспалительныхцитокиновубольныхГЛЭвостройстадииинфекции неадекватно высок, системное воспаление приводит к дисрегуляции реакций врожденного иммунитета, воспалительному поражению эндотелия сосудов и нарушению микроциркуляции воздуха в легкихсугрозойгеморрагическогоотека[58].Действиеклеточных систем противовирусной защиты парализовано блокадой клеточных сигнальных процессов [14, 59, 64, 97]. Для вируса Эбола – это блокада активации дсРНК-зависимой протеинкиназы, подавление

54

активности адаптерного белка, необходимого для активации протеинкиназ TBK-1 и IKKε белком VP35 и блокирование действия STAT1 на инициацию транскрипции генов интерферонов [47].

Молекула с cNLS

Цитоплазма

Ядро

Молекула с cNLS

Рис. 26. Механизмы блокады транслокации STAT1 в клеточное ядро под действием VP24 [59, 95, 96, 97]. Представлен импортин KPNA5 в комплексе с белком VP24. Фосфорилированная форма STAT1 представлена в виде димера PY-STAT1 в центре. Связывание VP24 приводит к блокированию димеризации STAT1 и его взаимодействия с KPNA5. Для блокирования транслокации достаточно связывания VP24 c областью узнавания уникального неклассического сайта ядерной локализации (ncNLS) в структуре KPNA5 cNLS – канонический сайт ядерной локализации. Impβ – импортин-β

55

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1.The Ebola virus VP35 protein functions as a type I IFN antagonist / C. F. Basler [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA. – 2000. – Vol. 97, № 22. – P. 12289–12294.

2.Bausch D. G. Outbreak of Ebola virus disease in Guinea: where ecology meets economy / D. G. Bausch, L. Schwarz // PLoS Negl Trop Dis. – 20014. – 8, № 7. – Р. e3056.

3.Belyi V. A. Unexpected inheritance: multiple integrations of ancient bornavirus and Ebolavirus / V. A. Belyi, A. J. Levine, A. M. Skalka // Marburgvirus sequences in vertebrate genomes. PLoS Pathology. – 2010. – Vol. 6. – Р. e1001030.

4.Structural dissection of Ebola virus and its assembly determinants using cryo-electron tomography. Proc Natl Acad Sci USA. – Vol. 109, № 11. – Р. 4275–4280. – 2012.

5.Bhattacharyya S. Endocytic pathways involved in filovirus entry: advances, implications and future directions / S. Bhattacharyya, N. Mulherkar, K. Chandran // Viruses. – 2012. – Vol. 4, № 12. – Р. 3647–3664.

6.Blinov V. M.«Dormant»immunosuppressivedomains(ISD)infiloviruses: activation of «Dormant» filoviruses by endogenous retroviruses / V. M. Blinov. URL: http://www.vector.nsc.ru/conf0999/posters/ blinov/ blinov.htm.

7.Structural rearrangement of Ebola virus VP40 begets multiple functions in the virus life cycle / Z. A. Bornholdt [et al.] // Cell. – 2013. – Vol. 154, № 4. – Р. 763–774.

8.Lectin-dependent enhancement of Ebola virus infection via soluble and transmembrane C-type lectin receptors / M. Brudner [et al.] // PLoS One. – 2013. – Vol. 8, № 4. – Р. e60838.

9.EbolavirusVP35proteinbindsdouble-strandedRNAandinhibitsalpha/ betainterferonproductioninducedbyRIG-Isignaling/W.B.Cárdenas[etal.]// J. Virol. – 2006. – Vol. 80, № 11. – Р. 5168–5178.

10.CDC. Ebola (Ebola virus desease): Virus Ecology Graphic. – 2014. URL: http://www.cdc.gov/vhf/ebola/resources/virus-ecology.html.

11.SuppressiveeffectofEbolavirusonTcellproliferationinvitroisprovided by a 125-kDa GP viral protein / A. A. Chepurnov [et al.] // Immunol Lett. – 1999. – Vol. 68, № 2-3. – Р. 257–261.

12.Small molecule inhibitors reveal Niemann-Pick C1 is essential for Ebola virus infection / M. Côté [et al.] // Nature. – 2011. – Vol. 477 (7364). – Р. 344–348.

13.Crowley J. Ebola and Marburg Virus. Genomic structure, comparative and molecular biology (crusberg@wpi.edu) / J. Crowley, T. Crusberg. URL: http://www.mcb.uct.ac.za/ebola/ebolagen.html.

56

14.Daugherty M. D. (2014) How a virus blocks a cellular emergency access lane to the nucleus, STAT! / M. D. Daugherty, H. S. Malik // Cell Host Microbe. – 2014. – Vol. 16, № 2. – Р. 150–152.

15.Delos S. E. Critical role for the cysteines flanking the internal fusion peptide of avian sarcoma/leukosis virus envelope glycoprotein / S. E. Delos, J. M. White // J. Virol. – 2000. – Vol. 74, № 20. – Р. 9738–9741.

16.Crystal structure of the matrix protein VP40 from Ebola virus. EMBO / A. Dessen [et al.] // The EMBO Journal. – 2000. – Vol. 19, № 16. – Р. 4228– 4236.

17.Ectodomain shedding of the glycoprotein GP of Ebola virus / O. Dolnik [et al.] // The EMBO Journal. – Vol. 23. – Р. 2175–2184.

18.The primed ebolavirus glycoprotein (19-Kilodalton GP1, 2): sequence and residues critical for host cell binding // J. Virol. – Vol. 83, № 7. – Р. 2883–2891.

19.Dutta D. Search for inhibitors of endocytosis: Intended specificity and unintendedconsequences/D.Dutta,J.G.Donaldson//CellLogist.–2012.– Vol. 2 (4). – Р. 203–208.

20.Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells / A. Egorov [et al.] // J. Virol. – 1998. – Vol. 72, № 8. – Р. 6437–6441.

21.Feldmann H.Ebolahaemorrhagicfever/H.Feldmann,T.W.Geisbert// Lancet. – 2011. – Vol. 377, № 9768. – Р. 849–862.

22.Experimental study on the possibility of treatment of some hemorrhagic fevers / G. Ignatyev [et al.] // J Biotechnol. – 2000. – Vol. 83, № 1–2. – Р. 67–76.

23.Institut de recherche pour le développement. Possible natural immunity to Ebola? Scientific bulletin. – 2010. – № 337. URL: http://en.ird.fr/content/ download/10314/ 157911/version/7/file/FAS337a-web.pdf.

24.Mutational analysis of the putative fusion domain of Ebola virus glycoprotein / H. Ito [et al.] // J. Virol. – 1999. – Vol. 73, № 10. – Р. 8907–8912.

25.Ebola virus VP30 is an RNA binding protein / S. P. John // J. of Virol. – 2007. – Vol. 81, № 17. – Р. 8967–8976.

26.Tetherin-mediated restriction of filovirus budding is antagonized by the Ebola glycoprotein / R. L. Kaletsky [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2009. – Vol. 106, № 8. – Р. 2886–2891.

27.Ebolavirus VP35 uses a bimodal strategy to bind dsRNA for innate immune suppression / C. R. Kimberlin [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA. – 2010. – Vol. 107, № 1. – Р. 314–319.

28.Crystal structure of human T cell leukemia virus type 1 gp21 ectodomain crystallized as a maltose-binding protein chimera reveals structural evolution of retroviral transmembrane proteins / B. Kobe [et al.] // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1999. 96(8):4319–4324.

57

29.Virus nomenclature below the species level: a standardizing nomenclaturefornaturalvariantsofvirusesassignedtothefamilyFiloviridae/J.H.Kuhn [et al.] // Arch. Virol. – 2013. – Vol. 158, № 1. – Р. 301–311.

30.Charge-surroundedpocketsandelectrostaticinteractionswithsmallions modulate the activity of retroviral fusion proteins / D. Lamb [et al.] // PLoS Pathog. – 2011. – Vol. 7, № 2. – Р. e1001268.

31.Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor / J. E. Lee [et al.] // Nature. – 2008. – Vol. 454, № 7201. – Р. 177–182.

32.Inhibition of Ebola virus infection: identification of Niemann-Pick C1 as the target by optimization of a chemical probe / K. Lee [et al.] // ACS Med Chem Lett. – 2013. – Vol. 4, № 2. – Р. 239−243.

33.Ebolavirus glycoprotein structure and mechanism of entry / J. E. Lee, E. O. Saphire // Future Virol. – 2009. – Vol. 4, № 6. – Р. 621–635.

34.Lee J. E. Neutralizing Ebolavirus: structural insights into the envelope glycoprotein and antibodies targeted against it / J. E. Lee, E. O. Saphire // Curr Opin Struct Biol. – 2009. – Vol. 19, № 4. – Р. 408–417.

35.Structure of the Ebola VP35 interferon inhibitory domain / D. W. Leung [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA. – 2009. – Vol. 106, № 2. – Р. 411–416.

36.MutualantagonismbetweentheEbolavirusVP35proteinandtheRIG-I activator PACT determines infection outcome / P. Luthra [et al.] // Cell Host Microbe. – 2013. – Vol. 14, № 1. – Р. 74–84.

37.Core structure of the envelope glycoprotein GP2 from Ebola virus at 1.9- Åresolution/V.N.Malashkevich[etal.] //ProcNatlAcadSciUSA.–1999.– Vol. 96, № 6. – Р. 2662-2667.

38.Placental syncytins: Genetic disjunction between the fusogenic and immunosuppressiveactivityofretroviralenvelopeproteins/M.Mangeney[etal.] // Proc Natl Acad Sci USA. – 2007. – Vol. 104, № 51. – Р. 20534–20539.

39.A Mutation in the Ebola virus envelope glycoprotein restricts viral entry in a host speciesand cell-type-specific manner. – Vol. 87, 6. – Р. 3324–3334.

40.Martin-Serrano J.HIV-1andEbolavirusencodesmallpeptidemotifsthat recruit Tsg101 to sites of particle assembly to facilitate egress / J. Martin-Serrano, T. Zang, P.D. Bieniasz// Nature Med. – 2001. – Vol. 7, № 12. – Р. 1313–1319.

41.Ebola virus entry requires the host-programmed recognition of an intracellular receptor / E. H. Miller [et al.] // J. The EMBO. – 2012. – Vol. 31, № 8. – Р. 1947–1960.

42.Miller E. H. Filovirus entry into cells – new insights / E. H. Miller, K. Chandran // Curr Opin Virol. – 2012. – Vol. 2, № 2. – Р. 206–214.

43.Miller K. Infection Mechanism of Genus Ebolavirus. Kenyon College, MicrobeWiki / K. Miller. – 2010. URL: http://microbewiki.kenyon.edu/index. php/Infection_Mechanism_of_Genus_Ebolavirus.

58

44.Antigenic subversion: a novel mechanism of host immune evasion by Ebola virus / G. S. Mohan [et al.] // PLoS Pathog. – 2012. – Vol. 8, № 12. – Р. e1003065.

45.Mühlberger E. Filovirus replication and transcription / E. Mühlberger // Future Virol. – 2007. – Vol. 2, № 2. – Р. 205–215.

46.Ebola virus VP40 drives the formation of virus-like filamentous particles along with GP / T. Noda [et al.] // J. Virol. – 2002. – Vol. 76, № 10. – Р. 4855–4865.

47.Okazaki T. Mitochondrial localization of the antiviral signaling adaptor IPS-1isimportantforitsinductionofcaspaseactivation/T.Okazaki,M.Higu- chi, Y. Gotoh // Genes Cells. – 2013. – Vol. 18, № 6. – Р. 493–501.

48.Ebola virus antibodies in fruit bats, Bangladesh / K. J. Olival [et al.] // Emerg Infect Dis. – 2013. – Vol. 9, № 2. – Р. 270–273.

49.Rossman J. S. (2012) Filamentous Influenza virus enters cells via micropinocytosis / J. S. Rossman, G. P. Leser, R. A. Lamb// J. Virol. – 2012. – Vol. 86, № 20. – Р. 10950–10960.

50.Cellular entry of Ebola virus involves uptake by a macropinocytosis-like mechanism and subsequent trafficking through early and late endosomes / M. F. Saeed [et al.] // PLoS Pathog. – 2010. – Vol. 6, № 9. – Р. e1001110.

51.Salzwedel K. A conserved tryptophan-rich motifin themembrane-prox- imal region of the human immunodeficiency virus type 1 gp41 ectodomain is important for Env-mediated fusion and virus infectivity / K. Salzwedel, J. T. West, E. Hunter // J. Virol. – 1999. – Vol. 73, № 3. – Р. 2469–2480.

52.Retroviral infection in vivo requires an immune escape virulence factor encryptedintheenvelopeproteinofoncoretroviruses/G.Schlecht-Louf[etal.] // Proc Natl Acad Sci USA. – 2010. – Vol.107, 8. – Р. 3782–3787.

53.The Ebola virus VP24 protein prevents hnRNP C1/C2 binding to karyopherinα1andpartiallyaltersitsnuclearimport/R.S.Shabman [etal.] // J. Infect Dis. 204 Suppl. – 2011. – Vol. 3. – Р. S904–S910.

54.Multiple cationic amphiphiles induce a Niemann-Pick C phenotype and pnhibitEbolavirusentryandinfection/C.J.Shoemaker[etal.] //PLoSONE.– 2013. – Vol. 8, № 2. – Р. e56265.

55.Stahelin R. V. Membrane binding and bending in Ebola VP40 assembly and egress / R. V. Stahelin // Front Microbiol. – 2014. – Vol. 5. – Р. 300.

56.Takada A. Filovirustropism:cellularmoleculesforviralentry/A.Takada // Front Microbio. – 2012. – Vol. 3. – Р. 34.

57.Taylor D. J. Filovirus are ancient and integrated into mammalian genomes / D. J. Taylor, R. W. Leach, J. Bruenn // BMC Evolutionary Biology. – 2010. – Vol. 10. – Р. 193.

58.Into the eye of the cytokine storm / J. R. Tisoncik [et al.] // Microbiol Mol Biol Rev. – 2012. – Vol. 76, № 1. – Р. 16–32.

59

59.VanHook A. M. How Ebola shuts down antiviral signaling / A. M. VanHook // Sci Signal. – 2014. – Vol. 7, № 339. – Р. ec216.

60.GP mRNA of Ebola virus is edited by the Ebola virus polymerase and by T7andvacciniaviruspolymerases/V.E.Volchkov[etal.] //Virology.–1995.– Vol. 214, № 2. – Р. 421–430.

61.Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme / J. M. White [et al.] // Crit Rev Biochem Mol Biol. – 2008. – Vol. 43, № 3. – Р. 189–219.

62.WHO. Background document: potential Ebola therapies and vaccines. September 3. – 2014.

63.WHO. Ebola virus desease. Fact sheet № 103. – 1014. http://www.who. int/mediacentre/factsheets/fs103/en/.

64.The Ebola virus interferon antagonist VP24 directly binds STAT1 and has a novel, pyramidal fold / A. P. P. Zhang [et al.] // PLoS Pathog. – 2012. – Vol. 8, № 2. – Р. e1002550.

65.Игнатьев Г. М. Экспериментальное изучение возможности лечения геморрагической лихорадки Марбург препаратом REMICADE / Г. М. Игнатьев, Е. К. Букин, Е. В. Отрашевская // Вестник РАМН. – 2004. – Т. 11. – С. 22–24.

66.Некоторые показатели иммунитета у животных, иммунизированных инактивированным вирусом Марбург после заражения гомологичным вирусом / Г. М. Игнатьев [и др.] // Вопросы вирусологии. – 1994. – Т. 39, № 1. – С. 13–17.

67.Экспериментальное изучение возможности лечения геморрагической лихорадки Марбург десфералом, рибавирином и гомологичным интерфероном / Г. М. Игнатьев [и др.] // Вопр. вирусологии. – 1991. – Т. 5. – С. 206–209.

68.Влияние сыворотки против фактора некроза опухоли на течение геморрагической лихорадки Марбург / Г. М. Игнатьев [и др.] // Вестник РАМН. – 1998. – Т. 3. – С. 35–38.

69.Геморрагическая лихорадка Эбола: свойства возбудителя и разработкавакцинихимиопрепаратов/О.И.Киселёв[идр.]//Молекулярная биология. – 2015.

70.Киселёв О. И. Геном пандемического вируса гриппа A/H1N1V-09 / О. И. Киселёв. – СПб. ; М. : Димитрэйд График Групп, 2011. – С. 164.

71.Киселёв О. И.Итогипандемиигриппа2009/11:Беременность,иммуносупрессия, грипп и плацентарная экспрессия эндогенных ретровирусов / О. И. Киселёв. – СПб. : Росток, 2014. – С. 320.

72.Киселёв О. И.Химиопрепараты и химиотерапия гриппа / О. И. Киселёв. – СПб. : Росток, 2012. – С. 267.

60