Молекулярная биология вируса Эбола. Учебное пособие

а)

Пептидслияния Сайткливеджа

–синцитин-2–ИСД

–GP2вирусЭбола–ИСД

Рис. 7. Строение белка Env вируса лейкемии мышей (F-MLV) и сравнение его фьюзогенных и иммуносупрессивных детерминант с белком GP1, 2 вируса Эбола [38, 52, 78, 88]; а – пространственная модель (слева) и линейная карта (справа) белка Env; три «лепестка»

поверхностного домена (ПД) соединены с тримером трансмембранного (ТМ) домена сульфгидрильными связями; спирали мономеров ТМ домена изогнуты в последовательности, соединяющей N-

и С-концевые гептаповторы; на линейной карте в ТМ домене показана последовательность ИСД, которая, несмотря на высокую гидрофобность, экспонирована на поверхности молекулы;

в последовательности выделены значимые аминокислотные замены

вположениях 14 (Глу-Арг) и 23 (Ала-Фен); б – пространственная модель GP1,2 вируса Эбола; в – сравнение первичных последовательностей ИСД в белках Env F-MLV, cинцитинe-2 и GP вируса Эбола

инфекционныхретровирусов[52].УвирусовЭболаидентичныепоследовательности играют роль фактора видовой адаптации и патогенности. Следовательно, различные семейства и таксономические

21

группы вирусов, вызывающих клинически совершенно различные заболевания, используют аналогичные пути подавления иммунитета хозяина для своей экспансии. Функциональная оценка иммуносупрессивной активности ИСД на трансплантируемых опухолях свидетельствует о том, что инфекционная и опухолевая иммуносупрессииимеютнетолькоидентичныемеханизмы,ноиидентичные мишени в иммунной системе хозяина [38, 52].

Ранее была продемонстрирована зависимость между проявлением иммуносупрессивных свойств, инфекционной активностью и виремией отструктуры последовательности ИСДонкогенныхретровирусов[38,52].Вчастности,показано,чтозаменыArg14наGluиPhe20 на Ala в ИСД ретровирусного белка Env приводили к утрате иммуносупрессивнойактивности,ноневлиялинамеханистическуюфьюзогенную функцию белка. При сохранении в Env аминокислотных остатков Arg14 и Phe20 наблюдается полное восстановление инфекционности вируса и его иммуносупрессивной активности [38]. Эти данные позволили авторам [38, 52] отнести исследованный домен к факторам вирулентности. Понятие «вирулентность» чаще относится к инфекционным вирусам, для которых характерна генетически детерминированная модуляция патогенности. Для вирусов, вызывающих опухоли, чаще применяются термины «онкогенность», «онкогенный потенциал» и т. д. Поэтому связь вирулентности с иммуносупрессиейпредставляетсявопросомпринципиальнымиимеющим объединяющее значение в понимании вирулентности как онкогенных, так и инфекционных вирусов [52, 71, 87].

Анализ дивергенции последовательностей ИСД свидетельствует о том, что эти домены играли существенную роль в эволюции вирусов. Так, сходные ИСД присутствуют в белках вирусов, относящихся к трем сильно дивергированным эволюционным ветвям:

–эндогенные ретровирусы;

–онкогенные ретровирусы (онкоретровирусы);

–инфекционные вирусы, включая высокопатогенные (напри-

мер, вирус Эбола) [6, 30, 71, 87, 89].

Тонкое картирование отдельных детерминант у вирусных белков – одно из продуктивных направлений молекулярного модели-

22

рования и кристаллографии. В этом направлении достигнуты значительные успехи в понимании функций коротких доменов белка GP2 и белков Env инфекционных ретровирусов [30]. В связи с очевиднымсходствомилокальнойгомологиейотдельныхдоменовбелков Env ретровирусов представляет интерес исследование, посвященное подробному анализу структуры шпильки слияния Env [30].

Для Env и других белков слияния класса I характерно обращение спирали внутри молекулы, в результате чего формируется суперспиральный (coiled-coil) домен, играющий важную роль в образовании тримера и инициации слияния с клеточной мембраной. В исследовании [30] авторы исходили из того, что концевая последовательность, обращенная в coiled-coil домене и стабилизующая его структуру, характеризуется тем, что на поверхности спирали экспонирован аминокислотный остаток Asn367. Такое экспонирование трех Asn (по одному в каждом мономере тримера)определяетструктурныеифункциональныеособенностиэтого домена. Было показано, что Asn367 высококонсервативен в эктодоменах белков слияния вирусов HTLV-1 [28]), MoMLV [17, 80, 17] и Эбола [37, 80], а также плацентарного белка cинцитина 1 [38]. В области этого аминокислотного остатка формируется характерная электронная плотность в виде кармана на поверхности молекулы, в который помещается анион хлора [30]. Мутационная замена Asn376 на Leu приводит к дестабилизации тримера и сопровождается утратой фьюзогенной активности. Такие же последствия имеет замена Asn376 на Asp [30].

На рис. 8 приведены данные по анализу домена LHR белка Env вируса бычьего лейкоза (BLV), который располагается дистальнее одной из цистеиновых петель этого белка: от последовательности инициации слияния, включающей другую цистеиновую петлю СХ6СС [30]. Согласно этим данным, домен LHR играет важную роль в переходе петли инициации слияния в структуру шпильки. Таким образом, контроль процессов слияния оказался для данной группы белков значительно сложнее, чем считалось ранее, и он, по-видимому, требует участия клеточного фермента ПДИ для перестройки (изомеризации) дисульфидных связей.

23

г)

Рис. 8. Структура тримера, образованного доменами шпильки слияния белка Env вируса бычьего лейкоза (BLV) [30]:

а – кристаллическая структура тримера шпильки (каждый мономер окрашен различными цветами); б – графическое представление мономера шпильки, содержащей N-концевую спираль и область обращения цепи (красный цвет), и образованного коротким α-спиральным мотивом, включенным в неорганизованную структуру, C-концевой LHR домен (желтый цвет); в – взаимодействие LHR домена в шпильке с выделением ключевых для взаимодействия и образования водородных связей аминокислотных остатков; гидрофобные аминокислоты Leu394, Ile396, Leu404, Leu406 составляют кластер гидрофобного взаимодействия в образовании шпильки; г – выравнивание последовательностей LHR домена белков вирусов BLV

и HTLV-1; консервативные аминокислотные остатки выделены

красным цветом, полуконсервативные – синим,

а неконсервативные – черным

24

Рис. 9. Роль молекул растворителя в тримеризации суперспиральных доменов [30]: а, б – срез тримера шпилек белка Env вируса бычьего лейкоза (BLV), на котором показаны малые молекулы растворителя в суперспиральных структурах, координированных Thr353 и Asn367; в – выравнивание последовательностей короткой области N-концевой спирали шпильки из белков различных вирусов (практически совпадает с последовательностью ИСД – см. рис. 7); обращает на себя внимание высокая консервативность Asn367, Arg368 и Аsp372; г – структурное наложение суперспиральных доменов белков

BLV (зеленый), HTLV-1 (желтый), синцитина (белый), MoMLV (бирюзовый) и вируса Эбола (пурпурный) [30]

25

На рис. 9 представлены результаты моделирования тримеризации суперспирального (coiled-coil) домена с учетом молекул растворителя из различных вирусных белков, включая синцитин-2 (HERV-FRD) [28, 30, 38, 52, 8, 88].

Таким образом, N-концевая спираль суперспиральных доменов поверхностных белков различных вирусов перекрывается с последовательностью ИСД [52, 71, 99], из чего следует полифункциональность ИСД [30]. Следует также отметить, что вирусы Эбола имеют неретровирусное происхождение [3, 30].

Тогдаправомоченвопросотом,какимобразомвпроцессеэволюции представителями этого семейства вирусов приобретен реальный гомолог ретровирусов в виде белка GP и его детерминант вирулентности? Наиболее вероятным объяснением является приобретение этого признака от хозяйских генов, например эндогенных ретровирусов [71, 87].

1.5. Литический домен в структуре -пептида вируса Эбола

Вирус Эбола при более детальном рассмотрении оказался вирусом, полным неожиданностей. В частности, изучение строения и моделирование структуры -пептида вируса Эбола [89] показало, что он содержит очень важную детерминанту патогенности, сходную с пептидом NSP4 ротавирусов (рис. 10). Наличие этого домена в вирусных белках отвечает за способность интегрироваться в мембраны клеток и вызывать образование пор, напоминающих ионные каналы [89]. Данный класс пептидов относится к виропоринам. Функциональной активностью этого домена можно объяснить быструю манифестацию диареи у больных ГЛЭ, как это свойственно при ротавирусных инфекциях. Следует обратить вниманиенатотфакт,чтоданныйдоменявляетсядетерминантой, вызывающей нарушение эпителиальных барьеров (кишечника, кожии,вероятно,эндотелия),чтонеизбежносопровождаетсяразвитием септических состояний, характерных для ГЛЭ.

Данноеисследование(рис.10)показало,чтоосновныеоткрытия в области идентификации генетических детерминант патогенности

26

а)

б)

Рис. 10. Структура -пептида вируса Эбола [89]: а – молекулярная модель -пептида. С-концевая часть -пептида (литический мотив)

изображена в виде амфипатической α-спирали с выделением выравнивания положительно заряженных аминокислот (аргинин и лизин); С-концевая часть может не формировать α-спираль в альтернативной конформации, в которой Cys29 и Cys38 образуют дисульфидную связь; б – сравнение helical wheel представлений спиральных структур литического пептида белка NSP4 ротавируса и С-концевого фрагмента -пептида вируса Эбола. Аминокислотные остатки лизина и аргинина очерчены голубым, цистеина – желтым, ароматические аминокислоты – черным цветом

27

вируса Эбола еще впереди. Классификатор генетических факторов патогенности будет способствовать повышению уровня молекулярногодизайнапротективныхвакцинипротивовирусныхпрепаратов.

Уровень исследований вируса Эбола можно оценить по базам данныхтретичнойструктурыиндивидуальныхбелков.Изпоследующего изложения будет видно, что активное использование данных третичной структуры вирусных белков позволяет решать на самомвысокомуровнеприкладные,исключительнопрактические задачи в области разработки лекарственных препаратов и вакцин.

Перед тем как перейти к описанию строения и функций другихвирусныхбелков,необходимозавершитьанализсостоянияис- следованийпоидентификациирецептор-связывающегосайтаGP, клеточногорецепторавирусаЭболаимеханизмовпроникновения этой группы вирусов в клетки.

1.6. Рецептор-связывающий сайт GP

Идентификация рецептор-связывающего сайта для вновь выявленного вируса представляется задачей исключительной важности по многим причинам. В первую очередь вирус-нейтрализу- ющий иммунитет, как правило, направлен на выработку антител именно на эти домены. У многих вирусов изменения в структуре рецептор-связывающего сайта связаны с адаптацией к новому хозяину и обретению возможностей преодоления межвидовых барьеров [5, 38, 39]. Создание средств, блокирующих рецептор-связы- вающий сайт, является наиболее перспективным направлением в создании химиопрепаратов [31].

В исследовании структуры рецептор-связывающего сайта авторы[18,31]исходилиизтого,чтопослепротеолитическойактивации вэндосомахкатепсинамибелокGP1,2содержитвсепоследовательности, необходимые для слияния с клеточной мембраной и взаи- модействиясрецептором[18,32,42,91].Масс-спектрометрический анализ показал, что белок GP1, 2 содержит последовательность от 33 до 190 а. о. GP1 и полную последовательность GP2. Дальнейший анализ показал, что рецептор-связывающий сайт локализуется в

28

более узкой области белка GP1 (90–149 а. о.). Для изучения роли отдельных аминокислотных остатков методом сайт-направленного мутагенеза была выбрана более широкая область белка – 57–149 а. о. [18]. В результате было установлено, что значительный вклад во взаимодействие с рецептором вносят аминокислотные остатки

Lys95, Lys114, Lys115, Lys140, расположенные на «верхушке» белка

GP1, 2 [18, 31]. Анализ пространственной структуры белка, полученной с помощью метода кристаллографии, позволил установить, что окончательные компоненты рецептор-связывающего сайта включают ковалентно-непрерывную последовательность 90–149 а. о. белка GP1 в качестве высококонсервативной области, состоящей издвухбета-слоев,двухвнутримолекулярныхдисульфидныхсвязей и четырех критически важных аминокислотных остатков лизина [18]. На рис. 11 представлены основные элементы третичной структуры рецептор-связывающего сайта вируса Эбола.

На рис. 11, в синим, зеленым и голубым цветом выделены ами-

нокислотные остатки, предварительно идентифицированные посредством мутагенеза в качестве компонентов рецептор-свя- зывающего сайта. Asp55, Leu57, Leu63 и Arg64 входят в состав последовательности, локализующейся в непосредственной близости от дисульфидной связи между GP1 и GP2. Эта последовательность играетважнуюрольвслияниисклеточноймембранойивконформационных переходах белка, обеспечивающих взаимодействие с рецептором. Phe159, Phe160, Tyr162 и Ile170 представляют собой кластер гидрофобных аминокислот, стабилизирующий структуру

GP1. Gly87, Phe88, Phe153 и His154 расположены проксимально от рецептор-связывающегосайтаиупакованынапротивкластераги- дрофобных аминокислот в структуре внутренней петли слияния. Мутации по этим аминокислотам нарушают структуру рецепторсвязывающего сайта или упаковку внутренней петли слияния. Lys114, Lys115, Lys140, Gly143, Pro146 и Cys147 могут входить в со-

став рецептор-связывающего сайта. Предполагается, что этот кластер положительно заряженных аминокислотных остатков может вносить вклад в связывание с рецептором. В отдельной рамке на рис. 11, в представлена молекулярная поверхность мономера GP.

29

Внутренняя петля слияния

Рис. 11. Строение рецептор-связывающего сайта белка GP1 [31]:

а– аминокислотные остатки, экспонированные на поверхности GP1

ивлияющие на строение рецептор-связывающего сайта;

б– организация рецептор-связывающего сайта и ближайших доменов, включая внутреннюю петлю слияния; в – сайт связывания рецептора

ирасщепления катепсином

Выделен (пурпурным цветом) сайт расщепления в петле между 190

и213 а. о., которая разрезается под действием протеаз. Это приводит к удалению гликанового кэпа, муциноподобного домена

ик освобождению GP2 и фрагмента GP1 [31].

1.7. Спектр клеточных рецепторов вируса Эбола

Вирус Эбола обладает способностью к использованию ряда клеточных рецепторов: транспортер холестерина Ниманна–Пика (NPC1), лектин С-типа, Fc-рецептор, C1q-рецептор (рис. 12).

Множественность специфических рецепторов для большинства вирусов – необычное свойство [5, 8, 18, 32, 41, 42, 56]. Именно множественность рецепторов и корецепторов определяет широкий

30