Молекулярная биология вируса Эбола. Учебное пособие

спектр тропности вируса Эбола к различным клеткам и органам [56]. Вне зависимости от пути инфицирования и первичного очага инфекции вирус Эбола быстро вызывает виремию и поражает многие органы и ткани [21]. В связи с этим становится понятно, почему вирус Эбола быстро вызывает системное поражение органов [21]. При этом следует иметь в виду, что в процессе развития инфекционного процесса вирус вызывает поражение эндотелия сосудов, что вносит значительный вклад в развитие терминальных состояний, коагулопатию и тотальную проницаемость сосудов [21].

ПроцесспервичногоинфицированияклетокувирусаЭболаотличается многостадийностью, взаимодействие со специфическим рецептором происходит уже внутри клеточных эндосом [18, 32, 41– 43, 50, 54, 56].

Ключевым и высокоспецифическим рецептором вируса Эбола является транспортер холестерина Ниманна–Пика С1 (NPC1) [12,

Рис. 12. Строение и функции рецепторов вируса Эбола [43, 49, 50, 56]

31

50, 54]. Мутации в белке NPC1 были идентифицированы у больных сфингомиелинозом,илиболезньюНиманна–Пика.Данноезаболе- вание связано с метаболическими нарушениями обмена липидов, проявляющимися в нарушении транспорта и накопления сфингомиелина в лизосомах клеток. Болезнь Ниманна–Пика объединяет группу сфингомиелолипидозов, характеризующихся накоплением сфингомиелина вследствие снижения активности сфингомиелиназы – фермента, катализирующего гидролиз сфингомиелина с образованием фосфатидилхолина и церамидов. Относится к группе заболеванийподобщимназванием«болезнилизосомальногонакопления липидов», или липидозы. Заболевание описали А. Ниманн в 1914 году и Д. Пик в 1922 году. Ранняя детская форма болезни Ни- манна–Пикавстречаетсясчастотойодинслучайна100000человек.

На рис. 13 представлена общая схема и последовательность внутриклеточных событий интернализации вируса Эбола в клет-

Рис. 13. Схема макропиноцитоза и взаимодействия с клеточным рецептором вируса Эбола [43, 50,54]

32

Рис. 14. Схема интернализации вирусов Эбола и Марбург с участием основного рецептора – NPC1 [12, 41, 42]

ки. Преимущественным способом проникновения вируса Эбола в клетки является макропиноцитоз. Парадоксально, что вирус Эболаоказалсясильнозависимымотпроникновениявклеткиипозднего распознавания специфического рецептора.

Связывание с NPC1 белка GP происходит на поздней стадии в эндосомах перед выходом вируса в цитоплазму клеток. При этом, по данным ряда публикаций, перед связыванием с рецептором ключевое значение имеет протеолиз GP цистеиновыми протеазами [8, 32, 41, 42, 56]. Выделяют следующие стадии процесса: взаимодействие с рецепторами, активация GP катепсином B/L, связывание с NPC1, участие дополнительных факторов слияния [43].

На рис. 14 видно, что основные события на раннем этапе инфицированияпроисходятвэндосомах,анетольконаповерхности клеточных мембран. Активация фьюзогенной активности GP завершается в эндосомах. В этих же органоидах происходит взаимо- действиесосновнымрецепторомвирусаЭбола–NPC1[12,32,54, 92].

33

На рис. 14 внутриклеточный трафик вируса разделен на три основные стадии: I, II и III. Фаза I соответствует присоединению вируса к клетке и интернализации в ранние эндосомы. Фаза II – перемещению в поздние эндосомы и протеолитическому созреванию под действием катепсинов. Фаза II включает активацию фуриновой протеазой и образование стабильного комплекса с рецептором NPC1. Первичное распознавание рецептора возможно также на стадии II (см. рис. 14).

Вирусные частицы адсорбируются на плазматической мембранепосредствомсвязываниясоднимилимножественнымидоменами. Первичная адсорбция вирусных частиц может осуществляться через электростатические взаимодействия или в результате связывания муциноподобного домена с лектинами, экспонированными на поверхности клеток. Затем вирус перемещается в ранние и поздние эндосомы [12, 50]. В этих клеточных компартментах под действием цистеиновых протеаз (катепсина В) происходит расщепление поверхностного GP с удалением муцинового домена и гликанового кэпа с последующей экспозицией рецептор-связыва- ющего сайта для взаимодействия с NPC1 [12, 54]. На этой стадии происходят наиболее важные события: выделение рибонуклеопротеинового комплекса вируса Эбола в цитоплазму клеток. Основные обозначения и последовательность стадий инфицирования клеток представлены на рис. 14 [39, 41, 54].

NPC1 имеет сложную трансмембранную организацию и включает13трансмембранныхдоменов,короткиедоменынаклеточной поверхности и протяженные последовательности, обращенные в цитоплазму клеток.

На рис. 15 приведены схематические структуры NPC1 и GP, представленного в исходной молекулярной форме и после протеолиза катепсином, удаления муцинового домена и гликанового кэпа. Протеолитический процессинг представлен в условном изображении: удалены муциноподобные домены, выделенные желтым цветом.

В[12]былисследованадамантан-содержащийблокаторNPC1в контексте вируса Эбола. На рис. 15 приведена структурная форму-

34

ла адамантан-содержащего блокатора [12]. В исследованиях функций NPC1 использовали клонированный ген hNPC1, экспрессия которого осуществлялась в клетках СНО, трансформированных соответствующим экспрессионным вектором. Блокатор, меченныйлюминесцентнымкрасителем,легковыявлялсявклетках,несущих ген hNPC1, в то время как контрольная культура клеток не связываласинтезированныевариантыблокатора[12].Дляанализа связывания с hNPC1 были использованы конъюгаты ингибитора с биотином [12, 32, 92]. Более того, исследования по связыванию соединений проводили на изолированных эндосомах, что делало экспериментылегкоконтролируемымиипозволялонавсехстадияхполучатьдостоверныерезультаты.Вэтихжеусловияхизучалось взаимодействие GP с рецептор-содержащими эндосомами. Для протеолиза GP использовалась протеаза термолизин. Это исследование представляет большой интерес не только с точки зрения фундаментальной идентификации ключевого рецептора для вируса Эбола, но и новых биохимических подходов в работе с малыми органическими молекулами. Очевидно, что исследованному в [12] препарату предстоит пройти большой путь апробации в доклинических и клинических испытаниях.

Остается непонятным вопрос о последствиях подавления активности NPC1 для метаболизма клеток, если принять во вни-

Рис. 15. Строение клеточного рецептора вируса Эбола – NPC1 [12]

35

мание, что мутации и нарушение функционирования этого белка приводят к развитию фенотипических проявлений наследственной патологии. Однако следует учитывать, что лечение вирусных инфекций при успешном применении противовирусных препаратов – процесс относительно кратковременный, проявление побочных явлений отсрочено во времени и часто совпадает с отменой лекарственного препарата в связи с выздоровлением.

Г л а в а 2

ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ ПРОТЕОМА ВИРУСА ЭБОЛА

После подробного описания поверхностного белка GP в данной главе будет представлено описание других основных и наиболее изученных компонентов протеома вируса Эбола [69]. В частности, будет приведено несколько примеров, иллюстрирующих значение исследований третичной структуры современными биофизическими методами для понимания функций белков вируса Эбола. Общее описание компонентов протеома вируса Эбола представлено в табл. 1.

2.1. Белок L– вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза

Большой структурный белок L вируса Эбола является каталитической субъединицей полимеразного комплекса, обладающей репликазной и транскриптазной активностями. Рентгеноструктурный анализ был осуществлен для отдельных фрагментов L. В настоящее время L является наименее изученным компонентом вируса Эбола.

Белок L включает домены, отвечающие за следующие каталитические активности: РНК-зависимой РНК-полимеразы

(EC:2.7.7.48), мРНК гуанин N(7)-метилтрансферазы (EC:2.1.1.56) и

мРНК гуанилилтрансферазы (EC:2.7.7.50). L катализирует транскрипцию вирусного генома и осуществляет кэпирование мРНК, необходимое для последующей трансляции, а также синтезирует

36

(+)-РНК на матрице (-)-РНК, а затем на матрице (+)-РНК – полноразмерную (-)-РНК, которая упаковывается в образующиеся вирусные частицы.

Поскольку геном вируса Эбола представлен (-)-РНК, вирус абсолютно зависим от собственной полимеразы. При этом, в отличие, например, от вирусов гриппа, вирус Эбола не зависит от ферментов кэпирования и осуществляет синтез 5`-кэпа в мРНК за счет собственных каталитических активностей.

2.2. Белок VP35

Белок VP35 является важнейшим фактором патогенности вируса Эбола. Этот белок был идентифицирован в качестве антагониста интерферонов I типа и является прямым функциональным гомологом белка NS1 вирусов гриппа.

На рис. 16 представлена линейная карта и третичная структура белка VP35 вируса Эбола [35, 36, 47, 100].

На карте белка выделены области олигомеризации, контроля репликации/транскрипции и дсРНК-связывающий домен.

Изучение вирусных антагонистов интерферона начались с идентификации белка NS1 вирусов гриппа типа А в качестве блокатораинтерфероновойклеточнойзащитыотвируснойинфекции [20,70].ИдентификациядсРНК-связывающегодоменавNS1сти- мулировала поиск идентичных доменов в других вирусных белках, что привело к выявлению антагониста интерферонов среди белков вируса Эбола [35, 36, 71]. На рис. 17 представлено сравнение третичных структур и дсРНК-связывающих сайтов фрагментов белков NS1 вирусов гриппа типа А и VP35 вируса Эбола с экспонированными сайтами, обогащенными аминокислотными остатками аргинина и лизина. Также на рис. 17 представлено сравнение аминокислотных последовательностей гомологичных дсРНКсвязывающих сайтов этих белков.

КонсенсуснаяпоследовательностьдсРНК-связывающегосайта у белков NS1 и VP35 полностью совпадает для пяти С-концевых аминокислотных остатков. В NS1 Arg37 экспонирован на по-

40