Молекулярная биология вируса Эбола. Учебное пособие

Репликация/транскрипция

б)

Линкер 1

Линкер 2

в)

Рис. 16. Модель строения С-концевого интерферон-ингибирующего домена (ИИД) белка VP35 вируса Эбола [35]: а – линейная карта доменной организации белка VP35; представлены основные структурные элементы: область олигомеризации, домены репликации

итранскрипции, ИИД, дсРНК-связывающий домен; б – ленточная модель кристаллической структуры С-концевого домена белка

VP35; пространственная структура фрагмента VP35 представлена в конформации, характерной для комплекса с дсРНК; в – топологическое строение белка, представленное в виде цилиндров (α-спирали), стрелок (β-структура) и петель (релаксированные области стыков); домены, имеющие α-спиральную организацию, выделены оранжевым цветом, домены с β-структурой – желтым цветом

41

Рис. 17. Модели дсРНК-связывающих фрагментов белков NS1 вируса гриппа типа А и VP35 вируса Эбола [35]: а – третичная структура дсРНК-связывающего (ИИД) VP35; б – третичная структура дсРНК-связывающего домена NS1; в – выравнивание восьмичленных последовательностей – «кора» дсРНКсвязывающего домена белков NS1 и VP35 [35]

верхности домена вместе с другими положительно заряженными аминокислотами (Arg38, Lys41, Arg44). В VP35 ключевые аминокислотные остатки дсРНК-связывающего домена (Arg305, Lys309, Arg312) также ориентированы на поверхности белковой глобулы с той разницей, что Arg312 локализован на границе перехода α-спирали в β-слой.

Детали бимодального взаимодействия VP35 с дсРНК представлены на рис. 18. Посередине изображения проведена псевдодву-

42

мерная ось симметрии, проходящая через центр дсРНК. Для молекул VP35 показаны два типа связывания: с фосфатным остовом и концевыми участками дсРНК. Электростатический потенциал асимметричного димера VP35 представлен в виде положительно заряженного кармана на конце обрыва дсРНК. Вклад гидрофобных взаимодействий выявлен при концевом связывании, а полярных – при взаимодействии с фосфатным остовом дсРНК.

ФункциибелкаVP35настольковажны,чтовзначительнойстепени определяют клинический исход заболевания. Это позволяет отнести данный белок к одним из ключевых факторов патогенности вируса Эбола [35, 36, 100].

Совершенство механизмов подавления вирусом Эбола активациипротивовируснойзащитыклетоксвязаностем,чтоVP35,кроме прямого вмешательства в процессы индукции интерферонов через конкуренцию с дсРНК, подавляет RIG-I-опосредованный

Рис. 18. Кристаллическая структура асимметричных компонентов комплекса интерферон-ингибирующего белка VP35 в комплексе с дсРНК длиной 18 п. н. (PDB: 3L25) [100]

43

противовирусный внутриклеточный сигнальный каскад на уровне белка стимулятора-1 промотора β-интерферона (IPS-1), активирующего протеинкиназы TBK-1 и IKKε [47].

RIG-I – семейство внутриклеточных паттерн-распознающих рецепторов, обеспечивающих внутриклеточное распознавание молекулвирусныхнуклеиновыхкислотпоконцевымтрифосфатным группам или по двуспиральной структуре [36]). Инициация противовирусного клеточного ответа осуществляется посредством передачи сигнала через адаптор IPS-1 [36, 47]). В первую очередь в случае эффективной передачи сигнала IPS-1 запускает продукцию β-интерферона. IPS-1 состоит из N-концевого каспазного домена, домена активации белок-белковых взаимодействий (CARD) и С-концевого трансмембранного домена, фиксирующего белок в митохондриальной мембране. IPS-1 также

В

Рис. 19. Сигнальный путь активации синтеза интерферонов через сенсор RIG-I и уровни блокады противовирусной клеточной защиты белком VP35 [35, 36, 47]). Мишенями белка VP35 являются вирусная (дсРНК), РНК с 5’-концевой трифосфатной группой, IPS-1 – адапторный белок сигнального транскрипционного комплекса, стимулятор транскрипции

гена β-интерферона [100]

44

известен как комплекс MAVS/VISA/Cardif, в котором основным фактором противовирусной защиты является митохондриальный сигнальный противовирусный белок (MAVS). Также установлено, что IPS-1 относится к семейству белков Bcl-2 и содержит BH3-подобный мотив [47]. Изучение функций этого мотива свидетельствует о том, что он является внутренним ингибитором активации каспаз и, следовательно, апоптоза. Для формирования активной противовирусной защиты IPS-1 проходит стадию олигомеризации, в результате которой формируется надмолекулярный сигнальный комплекс, обеспечивающий активацию транскрипционных факторов IRF3 и NF-κB, необходимых для продукции интерферона I типа.

Действие VP35 на сигнальные системы клеток не исчерпывается путями активации противовирусной защиты. Изучение реакции экспрессии клеточного генома на вирус Эбола показало, что спектр действия вирусной инфекции существенно шире. Вчастности,активациясигнальнойсистемытрансформирующего ростового фактора-бета (TGFβ) приводит к изменению фенотипа гепатоцитов к мезенхимальному типу [94]. Это позволяет понять, каким образом при ГЛЭ развивается патология печени. Эти данные приводят к необходимости детального рассмотрения возможностей применения для лечения ГЛЭ сигнальных ингибиторов,изначальноразработанныхдлятерапиионкологическихзаболеваний.

Таким образом, белок VP35, являясь антагонистом интерферонов, может быть отнесен к важнейшим факторам патогенности вирусов Эбола [35, 36, 47? 100] в такой же степени, как и белок NS1 вирусов гриппа типа А [20, 70]. Понимание путей подавления синтеза интерферонов при ГЛЭ позволяет надеяться на создание препаратов, направленных на снятие их блокировки. Однако для этой цели не могут быть использованы современные индукторы интерферонов, так как в условиях действующей блокады их действие неэффективно. В связи с этим необходимы новые решения этой проблемы.

45

2.3. Белок VP40

VP40 – вирусный белок матрикса длиной 326 а. о. [16]. В инфицированных клетках VP40 синтезируется в количествах, значительно превышающих уровень синтеза других шести вирусных белков. По мере накопления в клетках VP40 образует выстилку с внутренней стороны плазматической мембраны. VP40 инициирует почкование вирусных частиц, его экспрессии достаточно для образования вирусоподобных частиц. N- и C-концевой домены VP40in vitro образуют РНК-связанные кольцевые структуры. Для N-концевого доменаособеннохарактернообразованиекольцевыхструктур,способных связываться с тринуклеотидами мРНК. Такаяконформация свойственна N-концевому домену только в инфицированных клетках, и, вероятно, она связана с участием в процессе транскрипции вирусного генома (рис. 20). VP40 взаимодействует с мембранами инфицированнойклетки.Этоттипвзаимодействиябудетописандалее.

Одним из важнейших открытий в исследовании белка VP40 стало выявление у него общих свойств и идентичного структурного мотива с белком Gag ВИЧ-1. В этих белках идентифицирован тетрапептидный домен PTAP, который является лигандом белка Tsg101[40],контролирующегосистемувезикулярногоэндосомального внутриклеточного сортинга. Согласно текущим представлениям,этифункцииявляютсяважнымидлясудьбывирусавранних эндосомах [7, 40].

VP40 благодаря высокой конформационной подвижности обладает множеством функций, включая контроль транскрипции и репликации вирусной РНК. Его совершенство в первую очередь определяется подвижностью третичной структуры [7].

Нарис.21представленыупрощеннаясхемаипоследовательность событий в олигомеризации белка VP40 на внутренней поверхности плазматической мембраны инфицированных клеток. Мономер VP40 формирует димеры, которые связываются с фосфолипидами клеточных мембран благодаря экспонированным на поверхности молекулы кластерам положительно заряженных аминокислот. Это событие инициирует стыковку димеров с последующим образова-

46

Рис. 20. Пространственная модель белка VP40 вируса Эбола [16]:

а– ленточная модель третичной структуры VP40; два основных домена VP40 выделены разными цветами; белок содержит шесть α-спиралей

и12 β-слоев; область подвижной полипептидной спирали, включая стыковочную петлю (обозначена горизонтальной стрелкой), обозначена

прерывистой линией; сайт кливеджа после Lys212 обозначен вертикальной стрелкой; протеолитическое расщепление в этом сайте приводит к отделению С- и N-концевых доменов с последующей гексамеризацией N-концевого домена VP40; б – топологическая диаграмма двух доменов

VP40; β-слои обозначены стрелками, α-спирали – прямоугольниками

нием зигзагообразных гексамеров, составляющих основу вирусных филаментов. С-концевая гидрофобная петля проникает в мембраны на глубину 8,1 Å, что достаточно для инициации почкования и освобожденияфиламентарныхвирусныхчастицотплазматической мембраны инфицированных клеток (рис. 21).

VP40 в инфицированных клетках существует в трех молекулярных формах: димер, гексамер и октамер. Это довольно редкое явление. На рис. 21 представлен процесс олигомеризации вдоль внутренней стороны плазматической мембраны, однако это только общая картина, которая не отражает реальных молекулярных событий, происходящих с VP40. Димерная и гексамерная формы VP40выполняютдвеосновныефункции:связываниесмембранами

47

и индукция почкования вирусных частиц с их последующим высвобождением во внеклеточную среду. Октамер VP40 – это форма белка, проявляющая способность к связыванию с РНК, которая в видеоктамерногокольцавходитвсоставтранскрипционногокомплекса вируса Эбола. Такое понимание функций белка было достигнуто в результате исследований пространственной структуры методами кристаллографии [7]. Было показано, что олигомериза- цияVP40(какидругихвирусныхбелков)–этоспособдостижения мультифункциональности посредством значительных конформационных переходов и экспонирования доменов, придающих новые свойства исходному мономерному белку.

На рис. 22 представлена пространственная организация белка VP40 и его молекулярные формы.

Рис. 21. Модель динамики олигомеризации VP40 вируса Эбола при взаимодействии с плазматической мембраной клеток [55]:

PE – фосфатидилэтаноламин, PS – фосфатидилсерин, PI – фосфатидилинозитол, PI(4,5)P2 – фосфатидилинозтол- 4,5-дифосфат, PC – фосфатидилцерамид, SM-сфингомиелин. Фосфатидилсерин – играет ключевую роль

в почковании вируса Эбола

48

Димер

Гексамер

Октамер

Рис. 22. Структура димера, гексамера

иоктамера белка VP40 вируса Эбола [7]

–димер VP40 имеет форму «бабочки», обладает способностью

клатеральной диффузии по внутренней поверхности плазматической мембраны инфицированных клеток;

–гексамер VP40 составляет основу вирусных филаментов;

–октамер VP40 обладает способностью к связыванию с вирионной РНК и контролю процессов транскрипции и репликации.

2.4. Белок VP30

Белок VP30 является одним из компонентов нуклеокапсида, входит в состав транскрипционного комплекса, является инициатором транскрипции вирусных РНК и контролирует инкапсидацию осРНК в вирусные частицы [25]. VP30 представляет особый интерес в связи с его полифункциональностью и участием в контроле экспрессии вирусного генома.

49

а)

– пролин

– глицин

– серин

– треонин

б)

Рис. 23. Строение и функции VP30 вируса Эбола [25]: а – распределение гидрофобных кластеров в последовательности VP30 вируса Эбола; глобулярные области VP30 имеют утолщенное распределение гидрофобных кластеров, неструктурированные области (выделены черными полосами снизу диаграммы) практически полностью лишены гидрофобных кластеров; б – первичная структура VP30; последовательности, не имеющие организованной структуры, подчеркнуты; сверху последовательности белка нанесена предсказанная вторичная структура; аминокислотные остатки, входящие в состав РНК-связывающего сайта, выделены розовым цветом; зеленым цветом выделены аминокислотные остатки Cys и His, образующие Zn-фингер мотив (домен 61–95 а. о.)

50