Молекулярная биология вируса Эбола. Учебное пособие

Вседимерныеструктуры(GP1,2,sGPиssGP)опосредованыS-S- связями между субъединицами. На рис. 3 представлена линейная карта генома вируса Эбола [45], на которой выделены рамки считывания вирусных белков:

L – каталитическая субъединица комплекса вирусной РНКзависимой РНК-полимеразы [45];

NP – основной вирусный нуклеопротеин, участвующий в инкапсидации вирусной РНК;

VP35–белоквириона35,компонентвируснойРНК-зависимой РНК-полимеразы, является основным фактором вирулентности, относитсяквируснымбелкам–антагонистаминтерферонов,обес- печивая блокаду активации их синтеза (по-видимому, разделяя вирулентные свойства с другими белками, в частности с GP) [1, 9, 13, 44, 45];

а)

б)

NP + VP40

NP + VP24 +

+VP35 + VP40

EBOV

10 нм

Рис. 3. Строение вируса Эбола и локализация белков – кандидатов в вакцинные антигены [4, 45]: а – геномные карты вирусов Эбола и Марбург; б – строение и последовательность самосборки вирусного нуклеокапсида [4]; VP24, VP35 и VP40 через взаимодействие с NP направляют самосборку вирусного нуклеокапсида

11

VP40 – белок вириона 40, белок матрикса, участвует в сборке и почковании вирионов [45, 46];

GP (GP1, 2) – вирусный поверхностный гликопротеин, существующий в различных молекулярных формах, включая секреторную; GP образует шипы на поверхности вирионов, по третичной структуре напоминает HA вируса гриппа, содержит рецептор-свя- зывающий домен и основные домены связывания нейтрализующих антител;

sGP/ssGP – растворимые гликопротеины, sGP используется как компонент системы ускользания вируса от иммунного ответа

[43];

VP30 – белок вириона 35, минорный нуклеопротеин, ассоциирован с матриксным белком, участвует в инкапсидации вирусной РНК, представляет собой вирус-специфический транскрипционный активатор [45];

VP24 – белок вириона 24, минорный матриксный белок, является антагонистом сигнальных систем, обеспечивающих активацию противовируснойзащиты;VP24выступаетвкачествеконкурентного ингибитора фактора транскрипции STAT1 [13, 44, 50, 54, 71].

Функции противостояния системам противовирусной защиты у вируса Эбола распределены между разными белками. Так, например, подавление неспецифического иммунного ответа является функцией GP, который аналогично белку Vpu ВИЧ-1 снижает активность белка тетерина (Bst-2 или CD317) – клеточного фактора хозяина, обеспечивающего подавление почкования вирусных частиц и, следовательно, диссеминацию инфекции. Перечень мишеней среди компонентов иммунной системы для белков вируса Эбола можно продолжить до масштабов понимания защитных функций организма от вирусных инфекций [1, 13].

Основной выбор для проектирования и дизайна конструкции вакцин чаще всего связан с GP [71]. Другие компоненты вируса являются объектом для исследования факторов патогенности и разработки противовирусных препаратов. Следует обратить особое внимание на то, что GP вируса Эбола является белком слияния класса I,что и определяетобщие чертыего строениясповерх-

12

ностными белками других вирусов [26, 33, 37, 80, 81]. Это сходство играетчрезвычайноважнуюрольвконструированиивакцинидизайне противовирусных препаратов.

1.3.Строение и функции поверхностного гликопротеина GP вируса Эбола

GP является наиболее изученным компонентом вируса Эбола. Уже в 1998 году методом рентгеноструктурного анализа была расшифрована третичнаяструктура GP,установлено строение его отдельных детерминант, проведено тонкое картирование основных функциональных сайтов [37].

На рис. 4 приведены модели строения белков слияния вируса Эбола, вируса гриппа и вируса иммунодефицита обезьян. Видно очевидное сходство в строении белков в основных элементах третичной структуры. Сравнение линейных функциональных карт этих белков также демонстрирует высокое сходство и общность элементов их организации. Следует обратить особое внимание, что рецептор-связывающий домен GP находится под муциновой «шляпкой» ближе к основанию тримера [17, 33, 37, 61, 81, 82].

Пространственная модель GP приведена на рис. 5. N- и C-концевыедоменыGPсвязаныпоследовательностями,имеющи- ми важное функциональное значение в слиянии с клеточной мембраной. Эта область содержит мотив CX6CC, в котором цистеины Cys601 и Cys608 образуют дисульфидную связь, «заякоренную» на пептид в форме клеверного листа. Третий аминокислотный остаток цистеина в положении 609 закрепляет клеверный лист GP2 на аминокислотном остатке Cys53 основания GP1. Конфигурация и локализация этих дисульфидных связей у самого основания GP1 ограничивает подвижность между N- и C-концевыми гептадными повторами изгибом спирали, что обеспечивает сопряжение ротации GP1 со вторым гептадным повтором в процессе слияния с клеточной мембраной. Далее будет приведена структура внутренней петли слияния, также фиксированной дисульфидными связя-

ми между Cys511 и Cys 556 в GP2.

13

Рис. 4. Структура GP вируса Эбола в сравнении с другими вирусными белками слияния класса I [37]; [ 83]; [ 78]): а – модель строения GP вируса Эбола; б – сравнение третичной структуры GP вируса Эбола

сбелком Env вируса иммунодефицита и HA вируса гриппа А ([37];

в–сравнениелинейныхкартGPвирусаЭбола,Envвирусаиммунодефицита

иHAвирусагриппаАсуказаниемосновныхфункциональныхдоменов [83];г–сравнениебелковслиянияклассаIвирусаЭболаивирусовдругих таксономическихгрупп,выделеныосновныефункциональнозначимые домены,включаяобластьинициациислияния[78]

14

Рис. 5. Структура GP вируса Эбола [31, 33, 37]

15

На рис. 5, а представлена линейная карта GP с сайтом протеолиза фуриновой протеазой. На карте обозначены сайты гликозилирования, домены основания, головки и гликановой «шляпки» GP1, муциновый домен. В структуре GP2 выделены домены внутренней петли слияния (IFL), лейциновые гептадные повторы

(HR) и трансмембранный домен (TM) [15, 17, 24, 31, 33, 3781, 82, 84]. Рецептор-связывающий сайт локализован на молекуле GP1 (см. рис. 5). Однако функции слияния эволюционно закрепились за субъединицей GP2 [82].

На рис. 5, а представлена линейная карта доменов GP. Нумерация доменов и их окраска соответствуют модели кристаллической структуры GP; белая и заштрихованная области соответствуют кристаллографически неупорядоченной структуре полипептидной цепи, некоторые из этих участков частично делетированы при построении пространственной модели. SP – сигнальный пептид; I – основание GP1; II – головка GP1; III – гликановая «шляпка» GP1; муцин-муциноподобный домен GP; ФП – фуриновая протеаза; IFL – внутренняя петля слияния, HR1 – гептадный повтор 1; HR2 – гептадный повтор 2; MPER – экспонированная надмембранная проксимальная область GP; ТАСЕ – ФНОα-конвертирующий фермент; TM – трансмембранный домен; Y – сайты гликозилирования (звез- дочкой отмечены сайты, подвергающиеся мутациям в некоторых штаммах вирусов Эбола); б – модель молекулярной поверхности тримера GP в трех проекциях: вид слева, вид справа и трехмерное изображение; домены мономера А окрашены в соответствии с линейной картой на рис. 5 а. Мономеры B и C выделены белым и серым цветами соответственно. Предсказанные сайты гликозилирования локализованы в положениях по аминокислотным остаткам аспарагина: Asn228, Asn238, Asn257, Asn268, входящим в состав гликановой «шляпки»; гликановая «шляпка» выделена в мономере А овальным кольцом серого цвета; в – молекулярная поверхность GP; в нижней части трехмерной модели стрелкой обозначены спирали гептадного мотива 1 (HR1D) в тримере GP; RBS – рецептор-связывающий сайт.

16

На рис. 5, б представлена третичная структура GP1, на которой представлен рецептор-связывающий сайт, локализован белок GP2, показаны муциновый домен и координаты сайтов N-гликозилирования. GP является основным рецепторным белком вируса Эбола. Основная кристаллографическая модель GP вирусаЭболавключаетследующиеучасткибелка:33–189,214–278, 299–310 и 502–599 а. о. Электронная плотность отсутствует для участков190–213,311–312,464–501и600–632а.о.Слабаяилидис-

кретная электронная плотность характерна для петли, включающей дисульфидную связь между Cys53 и Cys609 GP1, 2, и внешних экспонированных доменов гликановой «шляпки» GP1 (268–278 и 299–310 а. о.). Эти участки моделировались как полиаланиновые фрагменты. Как видно на рис. 5, в, GP представляет собой чашу с «люлькой» («колыбелью»), образованную тремя субъединицами GP1 (чаша), помещенную на «люльку», образованную субъедини- цамиGP2(нарис.5,ввыделеныоранжевымцветом).Рецептор-свя- зывающий сайт утоплен во внутренней чаше белка GP, т. е. практически не экспонирован на поверхность в исходной конформации.

Протеолиз GP является критически важной стадией активации инфекционной активности вируса Эбола. При этом следует обратить внимание на то, что расщепление GP на две субъединицы, GP1 и GP2, осуществляется фуриновой протеазой. Примечательно, что HA высоко патогенных вирусов гриппа A/H5N1 также расщепляется фуриновой протеазой. Более того, этот протеолитический сайт у высоко патогенных вирусов гриппа имеет рекомбинантное происхождение и относится к детерминантам патогенности [73]. Как и в случае HA вирусов гриппа, субъединицы GP1 и GP2 вируса Эбола остаются ассоциированными в составе тримера и поддерживаются дисульфидной связью между Cys53 в GP1 и Cys609 в GP2 [37, 34, 81]. Однако уникальным свойством GP является генерирование дополнительной молекулярной формы, представляющей собой протеолитический фрагмент эктодомена. ОтщеплениеэктодоменапроисходитпоположениюAsp637вGP2под действием Zn-зависимой металлопротеазы TACE, относящейся к семейству ADAM [17].

17

Как было указано ранее, GP имеет общие признаки структурной организации с белками вирусов гриппа и иммунодефицита обезьян

ичеловека [37, 81, 84, 85]. Структурное сходство неслучайно: GP, как

ибелки целого ряда оболочечных вирусов, относится к белкам слияния класса I [33, 34, 81, 82, 84]. Особенностью строения и фьюзогенной активности GP вируса Эбола является локализация и струк- турадоменаслияния,илифьюжин-пептида[84],[82].Далеенарис.6 представленысхемастроенияиаминокислотнаяпоследовательность внутренней петли слияния GP2. Субъединицы GP1 и GP2, образующиеся после протеолитического расщепления, объединены дисульфиднойсвязью.Внутренняяпетляслиянияфланкированааминокислотными остатками цистеина, дисульфидная связь между которыми приводит к образованию экспонированной на поверхности белка петли [82]. Аминокислотные остатки цистеина в 511 и 556 положениях высоко консервативны, и именно они определяют строение данного домена. Аналогичная петля характерна для белка Env вируса саркомы/лейкозаптиц[15].РентгеноструктурныйанализGP2вируса Эболабылпроведендляэтогобелкавконформациипостфьюжина,в которой отсутствует домен слияния – Cys511-Cys556 петля [37]. Поэтому для более углубленного анализа строения этого функционально важногодоменаиспользовалисьметодысайт-направленногомутаге- неза[24]иядерногомагнитногорезонанса(ЯМР)[82].

Врезультате исследования структуры и фьюзогенной активно-

стипептидаEBO16 (рис.6)установлено,чтоэтотполипептидопределяет рН-зависимое слияние липосом, что соответствует функциям домена слияния в белке GP2 вируса Эбола [82]. Более того, функциональное значение этого домена подтверждается прямыми исследованиями связывания вирус-нейтрализующих антител: эпитопы для моноклональных антител 16F6 и KZ52 имеют девять общих аминокислот: 42–44 а. о. в GP1 и 513, 550–553, 556 а. о. в GP2 [15, 24, 31, 82]. Аминокислоты в положениях 513, 550–553

и556 а. о. входят в последовательность петли слияния.

Следует также учитывать, что процесс слияния вируса Эбола с клеткой при рассмотрении конформационных переходов и функций отдельных доменов GP отличается исключительной сложно-

18

а)

б)

Рис. 6. Строение и локализация петли пептида слияния, фланкированного аминокислотными остатками цистеина, в GP2 вируса Эбола [82]): а – аминокислотные последовательности петли слияния GP2 вируса Эбола (EbovFL) и пептида EBO16, использованного в исследованиях по изучению структуры этого домена методом ЯМР [82]; кластеры гидрофобных аминокислот выделены малиновым цветом, а фланкирующие аминокислотные остатки цистеина (Cys511-Cys556), образующие дисульфидную связь, – желтым; б – линейная карта GP вируса Эбола [31]; оранжевые вертикальные линии – аминокислотные остатки цистеина в петле слияния (серый цвет), пунктирные линии ограничивают область петли слияния в ее реальном расположении [82]. Сокращенные названия доменов представлены в описании к рис. 5

19

стью. Наряду с внутренней петлей слияния существенный вклад в эти процессы вносят последовательности инициации слияния, включающиедругуюцистеиновуюпетлюСХ6СС,ипоследовательность LHR (C-концевая последовательность шпильки в тримере белкаоболочкиретровирусов,содержащаякороткийα-спиральный мотив, включенный в неспирализованную структуру).

Более того, для большинства белков слияния класса I характерноучастиевэтихпроцессахпротеиндисульфидизомеразы(ПДИ). Иммуносупрессивный домен (ИСД) критически необходим для реализации последовательных стадий проникновения вируса в клетки. Эта последовательность является структурным компонентом домена, определяющего фьюзогенную активность GP [37].

1.4.Белок GP и его аналоги: белки Env эндогенных ретровирусов

иcинцитины

ДетальныеисследованияструктурыGPвирусаЭболапринеслинемало неожиданностей. В частности, между белком GP и белками Env ретровирусов на уровне третичной и отдельных элементов доменной структуры выявляется необычайное сходство. Сравнение моделей третичной структуры белка Env вируса лейкемии мышей (F-MLV) и белкаGPвирусаЭболапредставленонарис.7,приведенномизмонографии,посвященнойанализуструктуры,функцийипроисхождения синцитинов [71]. Также очевидно сходство и частичная гомология ИСД этих белков, что свидетельствует об идентичности их функционального предназначения [6, 28, 38, 39, 51, 71, 86–88]. Эти данные представлены для понимания одного из важнейших факторов патогенности в структуре анализируемых белков и объяснения его генетической природы у вируса Эбола [51, 71, 78, 87, 88].

Если провести сравнение общих элементов организации белка Envретровирусов,синцитиновплацентыибелкаGP1,2вирусаЭбола, то становится очевидным их структурное и эволюционное родство [38, 52, 78, 88]. Исследования функциональной роли иммуносупрессивного домена (ИСД) в белках ретровирусов показали, что эта детерминанта может быть отнесена к факторам патогенности

20