Методическая разработка по гистологическим методам исследования. Учебно-методическое пособие
.pdfнескольких срезов, переносят на чистые предметные стекла. Поверхность предметного стела предварительно смазывают раствором белка и глицерина
(1׃1). Раствор наносят на поверхность предметного стекла и тонким слоем размазывают по поверхности стекла с помощью подушечки пальца,
предварительно тщательно промытого и обезжиренного спиртом.
Способы подготовки предметных стекол, смеси для их промывки, раствора белка с глицерином для прикрепления с поверхности стекла описано в работах
(Меркулов, 1969, с. 81; Микроскопическая техника, 1996, с. 30; Мурадов, 2019,
с. 53).
Срезы после переноса на предметное стекло можно расправить, положив предметное стекло со срезами на нагревательный столик или снизу осторожно подогревая стекло огнем от спиртовки. После этого срезы прочно прикрепляются к поверхности предметного стекла.
Можно срезы прикреплять и к хорошо очищенной поверхности предметного стекла (Мурадов, 2019, с.53). Срезы переносят на каплю воду,
находящуюся на середине чистого предметного стекла, оттягивая излишки воды расправляют срезы. Предметное стекло можно положить на несгораемую темную (железную) подложку и подогреть спиртовкой снизу. Срезы расправляются и прочно прикрепляются к стеклу.
Чтобы окрасить прикрепленные к предметному стеклу срезы печени их нужно освободить от парафина. Это процедура носит название депарафинирование. Освободить срезы от парафина можно с помощью органических растворителей – бензола, ксилола, толуола, бензина.
Депарафинирование проводят по следующей схеме. Для этого необходимо предметное стекло со срезами последовательно погружать в стакан с ксилолом,
спиртом и дистиллированной водой. То есть провести по гистологической проводке.
-Ксилол I (первая порция) – выдержать стекло со срезами 10-15 минут при комнатной температуре (или в термостате при 370С);
-Ксилол II (вторая порция) – 3-5 минут;
51
-Спирт 100% I (первая смена) – 1-2 минуты;
-Спирт 100% II (вторая порция) – ополоснуть;
-Спирт 96% I (первая порция) – ополоснуть;
-Спирт 96% II (вторая порция) – ополоснуть;
- Дистиллированная вода – 2 смены.
Окрашивание срезов и заключение в бальзам. Если окрашивание препарата проводят в красителе на водной основе, то его после извлечения из дистиллированной воды можно сразу окрашивать. Если краситель на спиртовой основе, то препарат окрашивают после извлечения из второй порции 96% спирта.
Для окрашивания препарата из срезов печени можно использовать обзорные красители, окрашивающие цитоплазму и ядро – гематоксилин и эозин.
Способы приготовления гематоксилина и эозина описаны в руководствах
(Коржевский, 2010; Практикум по цитологии, 1998; Микроскопическая техника, 1996). Можно препараты окрашивать готовыми красителями, в частности, смесь азура и эозина. Растворы продаются в готовом виде. Перед применением их нужно разводить и подбирать оптимальные разведения, чтобы получить лучшее контрастирования клеток и клеточных структур. Следует отметить, что многие гистологические красители теперь можно приобретать в готовом виде. Обычно готовятся концентрированные растворы красителей, которые перед использованием необходимо разводить. В списке литературы приведены адреса производителей реактивов, красителей и других расходных материалов.
Окрашивание срезов на предметных стеклах можно провести, нанося капли красителя на поверхность среза. Нужно наносить краситель, чтобы он покрывал полностью срезы и выходил за пределы среза. Для уменьшения испарения красителя можно окрашивание производить под колпаком, помещая под нее препарат с красителем и рядом положить смоченную водой вату. Есть также способ окрашивания препаратов в специальных контейнерах, куда помешается одновременно несколько предметных стекол. После завершения окрашивания препарат нужно освободить от избытка красителя. Если окрашивание проводили красителем на водной основе, то препарат можно
52
несколько раз сполоснуть и дальше заключить в смесь «глицерин+желатин»,
накрыть чистым покровным стеклом. Тщательно отмытое и высушенное покровное стекло перед использованием нужно несколько раз окунув в 96%
спирт обезжирить и высушить.
При окрашивании срезов красителем на спиртовой основе, то после окончания окрашивания препарат промывают в чистом 96% спирте. Затем препарат последовательно переносят в 70% спирт, в дистиллированную воду и заключают в смесь «глицерин+желатин».
При заключении препарата в канадский бальзам препараты после окрашивания доводят до 96% спирта, смесь «ксилол+спирт», в чистый ксилол.
После этого наносят каплю канадского бальзама на срез и накрывают покровным стеклом.
Заключенные в смесь «глицерин+желатин» или канадский бальзам препараты хранятся годами не теряя качества. Хранятся готовые препараты в бумажных или пластиковых коробочках. Препараты подписывают карандашом по стеклу или справа приклеивают подписанную бумагу с указанием названия ткани и окраски.
Постоянный препарат в отличие от временного можно изучать под световым микроскопом неоднократно.
Препараты можно снимать с помощью фотокамер или выводить изображения на монитор компьютера с помощью видеокуляров, подключаемых к компьютеру с помощью USB-выходов, делать снимки.
Современные смартфоны позволяют получать фотографии и снимать видео, изучаемых на временных и постоянных препаратах биологических объектов (клеток, тканей, бактерий, одноклеточных простейших и. пр.). Для этого необходимо настроить фокус микроскопа на нужный участок препарате,
поднести глазок камеры смартфона к линзе окуляра микроскопа сделать фото или видео.
Перечень инструментов, оборудования, лабораторной посуды, реактивы и красители, необходимые для приготовления постоянного гистологического
53
препарата, приводится в руководстве (Зиматкин, 2022). У него же даются рекомендации по организации и оборудованию гистологической лаборатории
(Зиматкин, 2022). Подробные рекомендации по гистологической технике приготовления постоянного препарата с описанием помещения, оборудования,
лабораторной посуды, инструментов, расходных материалов, химических реактивов, красителей, микроскопов, техники безопасности приводятся в нескольких руководствах (Зиматкин, 2022; Паушева, 1988; Меркулов, 1969,
Микроскопическая техника, 1996; Камышников, 2011). Освоения основ гистологической техники приготовления постоянного препарата, в первую очередь, нужно начинать с руководств (Меркулов, 1969; Паушева, 1988), так как в них приводятся схемы и фото оборудования, инструментов, посуды, микротом и микроскопов для приготовления постоянного препарата, что делает эти руководства более наглядными.
Минимальный перечень – оборудования, инструментов, посуды,
реактивов, материалов - необходимого для приготовления и изучения гистологического препарата.
Оборудование:
брусок для точки ножей микротома, весы, водяная баня, микроскопы (МБР-1,
Микромед), микротом (санный или ротационный), микротомные ножи, плитка электрическая, ремень для правки ножей, станок для матировки стекол,
термостат.
Инструменты и посуда:
Блоки деревянные, бритвы безопасные (новые лезвия для бритья), бюретки,
бюксы стеклянные с крышкой, ведро эмалированное, воронки стеклянные разных размеров, кисточки, колпак стеклянный, коробки с черным дном,
коробки с ячейками для хранения препаратов, линейки, марлевые салфетки,
медицинский шприц, медный шприц, мерный цилиндр, металлические колпачки,
мыло, нитки, ножницы, пенициллиновые пузырьки, пинцеты, пипетки,
препаровальные стекла, препаровальные иглы, пробки корковые разных размеров, скальпели, склянки для фиксирующих смесей, склянки для спиртов на
54
100-200 мл с корковыми пробками, стеклянные трубочки, стеклянные палочки,
спиртовки, трафарет из черной бумаги, трафарет картонный для предметных
стекол, фарфоровые чашки с ручкой, фильтровальная бумага, нарезанная
полосками, часовые стекла, чашки Петри, химический стакан с носиком,
химический стакан с плоским дном на 1-2 л, эмалированный поднос, этикетки
бумажные 1х1 см.
Реактивы и материалы: Ацетон, анилин, бальзам канадский, бензин,
бисульфат натрия, борная кислота, бутиловый спирт, вазелиновое масло, вода
дистиллированная, воск пчелиный, гематоксилин, генциановый фиолетовый,
глицерин, желатина, железо-аммонийные квасцы, иммерсионное масло, йод
металлический, калий двухромовокислый, кармин, колхицин, ксилол мета,
куриный белок, лимонная кислота, лихтгрюн, медный купорос, метиленовый
синий, метиловый спирт, парафин, воск, серная кислота концентрированная,
соляная кислота концентрированная, спирт 960, спирт абсолютный, тимол,
толуол, уксусная кислота ледяная, фенол. Формалин продажный, формальдегид,
фуксин основной, хромовый ангидрид, хлороформ, эозин.
Вопросы для самоконтроля:
1.С какой целью готовят постоянный препарат и что он собой представляет? 2.Отличия временного и постоянного препаратов?
3.Основные этапы приготовления постоянного гистологического препарата?
4.Как получают биологический материал (кусочки органов)?
5.Зачем проводят фиксацию материала?
6.Как уплотняют материал?
7.Для чего использую канадский бальзам?
8.Почему важно соблюдать время фиксации, обезвоживания, пропитки парафином, депарафинирования?
9.Что означает словосочетание «гистологическая проводка»?
10. Какова толщина гистологического среза?
11.Какие инструменты, посуда, реактивы и красители необходимы для изготовления постоянного гистологического препарата? Где их можно приобрести?
12.Какие этапы приготовления гистологического препарата автоматизированы в крупных лабораториях на современном этапе?
55
Глава 5. Современные методы приготовления и изучения гистологических препаратов
Процесс получения гистологического препарата в последнее время во многом автоматизирован. Некоторые этапы выполняются автоматически
(Мавликеев, 2020). Можно ознакомится с современными приборами и технологиями автоматизированного получения препаратов в сети Интернет.
Другой способ изучения биологических объектов – это наблюдение живых объектов в средах под современным конфокальным световым микроскопом высокого разрешения. Конфокальная микроскопия имеет ряд преимуществ перед обычной широкопольной (светлопольной) микроскопией: несколько повышает разрешение микроскопа, позволяет изучать срезы на разной глубине,
что невозможно при использовании обычного микроскопа (Алиева, 2010;
Большой практикум…, 2021). В Большом практикуме более подробно описаны современные возможности различных видов световой микроскопии.
Хороший обзор по современным методам световой микроскопии и их возможностям представлен в статье (Бородин, 2019).
Для изучения живой крови применяют метод гемосканирования, где изображения клеток крови выводятся на экран компьютера. В программном обеспечении данного метода заложены возможности изучения морфологии клеток. Подробнее с этим методом можно ознакомиться в статье (Соснин, 2014).
Современные электронные микроскопы высокого разрешения и их возможности в биологических исследования описаны на сайте «https://eltemiks- lab.ru/wp-content/uploads/2019/09/380abc898e679d
8a81e2574c0bb76902.pdf». Некоторые из описанных сканирующих электронных микроскопов (серия EVO), представленные на указанном сайте позволяют изучать и получать изображения, например, бактерий и грибков в их естественной среде. Автоэмиссионные сканирующие электронные микроскопы серии GeminiSEM дают разрешение до 0,4 нм. Атомно-силовой микроскоп позволяет визуализировать молекулы белка на поверхности белковой оболочки
56
одиночного вируса. Про принципы работы, использование новых электронных
микроскопом можно подробно почитать на указанном сайте. Атомная силовая
электронная и лазерная микроскопия описаны в статье (Потатуркина-Нестерова,
2012).
Особое место на современном этапе изучения гистологии занимают
цифровые технологии. Создание виртуальных цифровых гистологических
атласов препаратов сделало изучение гистологии более доступным и менее
затратным. В работе А. В. Павлова (Павлов, 2019) изложены основные
возможности и направления виртуальной гистологии.
Использование интерактивных форм обучения по гистологии описано в
работе (Скачкова, 2009).
Вопросы для самоконтроля:
1.Изменилась ли в современных микроскопах разрешающая способность?
2.Какие преимущества у современного конфокального микроскопа перед обычным светлопольным световым микроскопом?
3.Как производят фотографирование и фотосъемку изучаемого объекта с помощью современных микроскопов?
4.Как изменились возможности современных электронных микроскопов?
5.В чем различия при исследовании крови при использовании гематологического анализатора и метода гемосканирования?
6.Зачем создают виртуальные гистологические атласы?
7.Что дает интерактивная обучения гистологии?
57
Заключение
В работе Окуловой И.И. с соавторами (Окулова, 2018) было установлено,
что выполнение учебных заданий по гистологии в форме «Пресс-конференций»,
со слов обследованных студентов вуза, было наиболее полезным и познавательным. При этой активной форме обучения гистологии студенты были распределены на две группы: одна группа выступала в качестве журналистов,
другая – научных деятелей. «Научные деятели» отвечали на вопросы
«Журналистов», преподаватели выступали в качестве сторонних наблюдателей,
отмечая активность студентов. То есть использовали активные формы обучения дисциплины, когда обучающийся активно вовлекается в познавательный процесс. Это вызывало больший интерес, и студенты проявляли самостоятельность. Возможно, что приготовление доступных временных препаратов в школах и вузах по дисциплинам цитология, гистология и эмбриология во время проведения практических занятий будет способствовать активизации познавательной деятельности школьников и студентов, пониманию и закреплению структурных основ живых объектов, различных уровней структурной организации живых систем. Использование простых методов изготовления и изучения препаратов по гистологии, эмбриологии и цитологии,
отражающих темы учебной программы, могут повысить уровень биологической грамотности и образованности обучающихся.
Учителя и преподаватели школы и вуза в данном пособии найдут материалы, отражающие краткие теоретические основы гистологических методов исследования и конкретные методики приготовления временных препаратов. Можно школьникам и студентам давать практические задание по приготовлению живых временных препаратов. Что касается постоянных гистологических препаратов большинства тканей, то их изготовление требуют специальных лабораторных условий и специального оборудования. Поэтому из данного пособия они могут ознакомится с упрощенными методами перевода временных препаратов в постоянные препараты, например, простыми в
58
изготовлении могут быть мазки крови рыб, лягушек, отпечатки печени крупного рогатого скота и пр. После фиксации и окрашивания их легко заключить в глицерин или канадский бальзам. При этом не требуется пропитка парафином,
изготовление срезов и т.д.
Для работников клинических лабораторий это пособие может оказаться полезным, так как в ней описаны способы приготовления некоторых препаратов
(мазков крови), методы работы со световым микроскопом и микроскопирования препаратов.
Методы работы с клетками и тканями могут оказаться полезными для будущих клеточных и молекулярных биологов, клеточных и тканевых инженеров.
59
Список рекомендуемой литературы
Абумуслимов С. С. Практическое пособие по цитологии/С. С. Абумуслимов. –
Грозный: Издательство Чеченского государственного университета. – 2009. – 34
с. (приводятся методики приготовления временных (живых) препаратов животных и растительных клеток).
Абумуслимов С. С. Учебно-методическая разработка к практическим занятиям по общей гистологии/С. С. Абумуслимов. - Грозный: Издательство Чеченского государственного университета. – 2013. – 33 с. (приводятся методики приготовления временных (живых) препаратов тканей животных).
Алиева И. Б. Методы клеточной биологии, используемые в цитогенетике.
Учебное пособие для проведения практических занятий по курсу
«Цитогенетика»/И. Б. Алиева, И. И. Киреев, С. Ю. Курчашова и [др.]. – М.:
Издательство МГУ. – 131 с. (методы приготовления цитогенетических препаратов, прижизненное наблюдение клеток).
Аппельт Г. Введение в методы микрсокопического исследования/Г. Аппельт. –
М.: Государственное издательство медицинской литературы. – 1959. – 429 с. (базовые сведения по световой микроскопии).
Бетехтина А. А. Микротехнические исследования на базе современного оборудования. Руководство к практическим занятиям/А. А. Бетехтина, И. А.
Уткина. – Екатеринбург: Уральский государственный университет. – 2008. – 110
с. (подробно о гистологической технике).
Биология [Электронный ресурс]: в 3 т. Т.1/Д. Тейлор, Н. Грин, У. Стаут; под ред.
Р. Сопера; пер. 3-го англ. Изд. – 4-е изд., (эл.). – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. – 2013. – 454 с. (базовые сведения и микроскопии, окрашивании препаратов).
Большой практикум по клеточной биологии. Учебное пособие для студентов старших курсов биологических специальностей/Под редакцией: доктора биологических наук Р. Э. Узбекова. – М.: Издательство «Перо». – 2021. – 468 с. (подробное практическое руководство по методам цитологии и клеточной
60