Методическая разработка по гистологическим методам исследования. Учебно-методическое пособие

и они могут по разному прокрашиваться красителями. В частности, в аксоны не заходит тигроид, а в дендритах в месте отхождения от тела нейрона можно встретить базофильный тигроид. Тигроид представляет собой локальные скопления гранулярного эндоплазматического ретикулума. В нейронах очень хорошо выявляются фибриллярные структуры – нейрофибриллы, заполняющие всю цитоплазму. Кроме того, в нервных клетках хорошо выявляются глыбки базофильного вещества. Это так называемая субстанция Ниссля,

хроматофильная субстанция или тигроид.

Некоторые клетки многоклеточного организма для изучения можно получить довольно просто, не прилагая больших усилий, например, клетки крови, костного мозга, лимфы, используя смывы или выделения из дыхательных путей и т. д. Однако при изготовлении препаратов, например, тканей необходимо готовить препараты из различных участков организма животного. При изготовлении гистологических препаратов, обычно, делают срезы из органов животного. При этом мы получаем кусочки материала, на котором мы увидим смесь из тканей, так как органы животного преимущественно формируются с участием всех четырех основных групп тканей. Гистологическое исследование органов является задачей частной гистологии. Поэтому важно заметить, что на препаратах органов мы увидим совокупность тканей, которые могут иметь морфологически различимые границы, сохранять свои морфологические признаки и окрашиваться по-разному, то есть иметь разные тинкториальные свойства.

Сведения о строении клеток и тканей растений можно почерпнуть из учебников по ботанике. Если говорить о клеточном строении растений в общих чертах это схоже с животными, но имеются различия. Ткани растений также могут иметь морфологические отличия от тканей животных. Поэтому, когда приводятся препараты из растительных объектов необходимо обратиться к руководствам по ботанике.

11

Таким образом, при микроскопировании клеток и тканей имеют важное

значение все вышеперечисленные морфологические признаки и тинкториальные

свойства клеток, тканей и структур, входящих в их состав.

Теоретические основы цитологии, гистологии и эмбриологии можно

посмотреть в источниках (Быков, 1997; Быков, 1998; Ченцов, 1984; Ченцов, 1995;

Гистология, 2001). Для ознакомления с микроструктурой и ультраструктурой

клеток, тканей и органов потребуются атласы и руководства (Юшканцева, 2006;

Гистология, цитология и эмбриология: Атлас…, 1996). Хорошие электронные

микрофотографии клеток и клеточных структур приводятся в учебнике Ю. С.

Ченцова (Ченцов, 1984). При изучении препаратов под микроскопом атласы и

практикумы помогают ориентироваться в морфологии изучаемых клеток, тканей

и органов.

Вопросы для самоконтроля:

1.Какие уровни организации живой материи Вы знаете?

2.Дайте определение клетки.

3.Дайте определение ткани.

4.Чем отличаются эукариотические клетки от прокариотических клеток?

5.Приведите примеры одноклеточных эукариотических клеток среди живых организмов.

6.Приведите примеры прокариотических клеток.

7.Назовите морфологические и функциональные различия животных и растительных клеток.

8.Назовите основные структурные особенности прокариотической и эукариотической клеток.

9. Назовите основные группы тканей, которые изучает общая гистология. 10.Какие структурные особенности тканей отличает это уровень организации о клеточного уровня?

11.Что означает понятие «тинкториальные свойства» клеток и тканей? 12.Дайте пояснения терминам «базофилия», «оксифилия» и «нейтрофилия». 13.Приведите примеры ядерных красителей?

14.Приведите примеры цитоплазматических красителей?

12

Глава 2. Методы исследования клеток и тканей

2.1 Световая микроскопия, разновидности световой

микроскопии, электронная микроскопия

Среди методов исследования клеток и тканей ключевое место занимает микроскопия. Это использование специальных оптических устройств,

увеличивающих размеры клеток и тканей. Два основных вида микроскопии,

используемых в области цитологии, клеточной биологии, гистологии и эмбриологии, это световая и электронная микроскопия.

Большинство клеток и тканей животных и растений, одноклеточных простейших и прокариотических клеток не видны невооруженным взглядом, так как разрешающая способность человеческого глаза не позволяет увидеть микроскопические объекты. Примерные размеры живых объектов представлены на нижеприведенном рисунке 1.

Рис. 1. Размеры живых объектов. Рядом с объектами указаны их размеры. Для микротрубочек и вируса указаны диаметры (d).

13

Разрешающая способность – это главная характеристика микроскопов.

Рассмотрим разрешающие способности человеческого глаза, светового и электронного микроскопов и размеры живых объектов, изучаемых с помощью микроскопов (рис. 2).

Рис. 2. Инструменты (лупа, микроскопы, рентген) для изучения клеток и тканей. У инструментов указаны величины их разрешающей способности (например, световой микроскоп имеет разрешение равное 0,2 μm, или 0,2 мкм).

Размеры большинства прокариотических клеток находятся в пределах от

0,5 до 5 микрометров. 1 микрометр – миллионная доля метра (сокращенная запись: 1 мкм). Также для описания размеров клеток и тканей используют и более мелкие деления. 1 нанометр – миллиардная доля метра (сокращенная запись: 1 нм). Толщина нити ДНК, лишенной связанных с ней белков, равняется

2 нм, а толщина микротрубочки – 25 нм.

Размеры большинства эукариотических клеток – 10-50 мкм (рис. 1),

например, размер тромбоцита крови человека равняется 3-4 мкм, эритроцита –

14

7- 8 мкм, фибробласта 30-40 мкм. Отдельные эукариотические клетки могут достигать размеров более 100 мкм (яйцеклетки, нервные клетки, мышечные).

Наш глаз различает объекты (клетки, ткани) большие, чем 100 мкм. 100

мкм или 0,1 мм – это разрешающая способность нашего глаза. Объекты меньше ста микрометров наш глаз не может различить. Поэтому мы используем световой микроскоп, чтобы увеличить размеры наблюдаемых объектов. Световой микроскоп различает объекты (клеточные структуры) большие, чем 0,2 мкм. 0,2

мкм или 200 нм – это разрешающая способность светового микроскопа.

Разрешающая способность – это минимальное расстояние между двумя точками,

которые воспринимаются раздельно. Разрешающая способность светового микроскопа определяется по формуле:

d = 0,61∙λ/n∙sinα

где λ – длина волны света, используемого для освещения объекта; n –

коэффициент преломления среды между линзой объектива и покровным стеклом препарата; α – угол между оптической осью объектива и наиболее отклоняющимся лучом, попадающим в объектив; n∙sinα – числовая апертура микроскопа.

Как видно из формулы разрешающая способность светового микроскопа зависит от длины волны дневного света. Длина волны дневного света в видимой области спектра равняется 400-700 нм, поэтому подставив эти значения в формулу мы получаем разрешающую способность светового микроскопа равную 200-350 нм (0,2-0,35 мкм). Если использовать ультрафиолетовый свет

(260-280 нм), то разрешающая способность повысится до 130-140 нм (0,13-0,14

мкм) (Ченцов, 1984).

Следовательно, большинство клеток мы можем различать и изучать только под световым микроскопом. Под световым микроскопом мы можем увидеть общий план строения клетки, различать отдельные органеллы (митохондрии,

центриоли) или их скопления (эндоплазматическая сеть, крупные фибриллярные цитоскелетные структуры).

15

Структуры клетки меньше 0,2 мкм мы можем видеть под электронным микроскопом. Его разрешающая способность для биологических объектов равняется 1-2 нм. Под электронным микроскопом мы можем увидеть некоторые органеллы и компоненты клетки. Например, под электронным микроскопом мы можем различать рибосомы (20-25 нм), актиновые филаменты (5-7 нм),

мембрану органелл и самой клетки (7-10 нм). Как отмечено выше, с помощью электронного микроскопа можно увидеть даже молекулу ДНК в ядре, если предварительно произвести деконденсацию хроматина.

Рассмотрим строение светового микроскопа (рис. 3) и правила работы с ним на примере простого варианта с зеркалом для освещения объекта.

Рис. 3. Строение монокулярного светового микроскопа с зеркалом для подсветки

Умикроскопа можно выделить три части: механическую, осветительную

иоптическую. Оптическая часть служит для создания увеличенного изображения исследуемого объекта. Она включает объективы и окуляры.

Причем объективы и окуляры могут иметь различное увеличение. Объективы,

устанавливаются в гнезда револьверного устройства тубуса. Это позволяет выбирать объектив нужного увеличения. Окуляр вставляется в тубус.

При необходимости повысить увеличение окуляра его можно легко сменить.

16

Объектив – представляет собой сложную систему линз (рис. 3). На объективе имеется маркировка (надписи) его технических и оптических характеристик.

На советских и российских микроскопах чаще используются объективы с увеличениями х8, х20, х40, х90. По особенностям использования и конструкции объективы подразделяют на сухие (х8, х20, х40) и иммерсионные (х90). На более поздних вариантах микроскопов есть масляные иммерсионные объективы с увеличением х100, а также объективы (х40) с водной иммерсией. Окуляр увеличивает изображение, созданное объективом. Чаще всего используют окуляры х5, х7, х10, х15. Увеличение окуляра бывает не более х20. Окуляр создает дополнительное увеличенное изображение объекта и работает как лупа.

Окуляр состоит из двух групп линз: глазной (ближайший к глазу наблюдателя) и

полевой (ближайшей к плоскости построенного объективом изображения).

Характеристикой окуляра является его линейное и угловое поля, а также окулярное число. Чем больше окулярное число, тем выше класс окуляра. Для окуляра используется маркировка, отражающая его характеристики (табл. 3). В

частности, на данном рисунке показаны два окуляра с пятикратным и семикратным увеличениями.

Рис.3. Окуляр светового микроскопа. Слева – вид окуляра сбоку, сверху А) и в разрезе (Б). На разрезе окуляра видны две оптические линзы. Справа – вид объектива (В) сбоку. На объектив нанесена маркировка с ее оптическими характеристиками

17

На поверхности объективов новых современных микроскопов указываются некоторые его характеристики: увеличение, надпись об исправлении аббераций света, проходящего через объектив, числовая апертура

(произведение коэффициента преломления света и угла между краевой зоной линзы объектива и оптической осью света, которая совпадает с перпендикулярным лучом, проходящим через середину линзы объектива. На более ранних версиях характеристик было меньше. Дело в том, что у современных объективов устранены различные абберации света. В таблице 1

приводятся данные о наносимых на поверхность объектива характеристиках. Как видно из таблицы многие характеристики объектива говорят об оптической коррекции.

Таблица 1. Маркировка объективов микроскопа

18

Таблица 1. Маркировка объективов микроскопа (продолжение)

19

Таблица 1. Маркировка объективов микроскопа (продолжение)

20