Методическая разработка по гистологическим методам исследования. Учебно-методическое пособие

среды оттягивают фильтровальной бумагой или пипеткой. Из-за того, что каплю придавливают при приготовлении препарата метод получил название

«раздавленная капля».

Для приготовления препарата «висячая капля» нужно предметное стекло с лункой в центре. Края лунки обмазывают вазелином, на покровное стекло наносят каплю с бактериями или микроорганизмами, переворачивают покровное стекло каплей вниз и прикрепляют к боковым поверхностям лунки на предметном стекле. Получается закрытая герметичная камера, в которой микроорганизмы могут жить некоторое время. В таких камерах удобно наблюдать размножение и движение микроорганизмов.

Метод приготовления мазка с простым окрашиванием предполагает фиксацию исследуемого биологического объекта. Пипеткой наносят каплю суспензии бактерий на предметное стекло и распределяют в виде тонкого мазка боковым ребром предметного стекла. Мокрый мазок высушивают, держа предметное стекло над пламенем горелки (5-6 секунд), стараясь не перегревать тонкий слой из бактерий на поверхности предметного стекла или можно провести фиксацию в течение 10-15 минут этиловым спиртом (960). Далее наливают сверху краситель, полностью покрывая им слой бактерий (мазок). По истечении времени окрашивания, рекомендованного для данного красителя, его сливают со стекла. Предметно стекло прополаскивают в дистиллированной воде несколько раз и подсушивают препарат. Теперь препарат можно микроскопировать с иммерсионным маслом и иммерсионным объективом.

Покровным стеклом не накрывают.

Метод отпечатка позволяет изучать морфологию клеток микроорганизмов на поверхности субстрата или пищевого продукта, естественное расположение бактерий на поверхности субстрата. Для приготовления отпечатка чистое предметное стекло прикладывают к поверхности субстрата и слегка прижимают к поверхности. На предметном стекле остается тонкий слой субстрата с бактериями. Далее можно провести фиксацию спиртом, как это описано выше для приготовления мазка.

41

Отпечатки можно получать непосредственно с органов животного,

например, отпечатки ткани печень, селезенки, тимуса, почки слизистой мочевого пузыря, слизистой оболочки щеки и пр. Для приготовления отпечатка печени получают свежий срезанный кусочек печени. Прикладывают срезанной стороной кусочек печени к поверхности чистого предметного стекла и несильно прижимают к его поверхности. На поверхности остается слой клеток печени.

Можно провести фиксацию и окрашивание препарата. В дальнейшем изучать его как мазок, не покрывая покровным стеклом. На препарате-отпечатке печени после окрашивания гематоксилином и эозином хорошо видно множество хорошо сохранившихся клеток печени (гепатоцитов), сохраняется структура ткани печени.

Можно на отпечатки на предметном стекле, например, отпечаток печени налить каплю изотонического физиологического раствора (0,9% NaCl), накрыть покровным стеклом и изучать морфологию живых клеток и тканей печени.

При рассмотрении временных живых препаратов под микроскопом рекомендуется немного прикрывать ирисовую диафрагму, если используется метод светлого поля. Временные препараты можно изучать и в фазово-

контрастном микроскопе.

3.2 Методы перевода временных препаратов в постоянные

Временные препараты из живых биологических объектов, как правило,

быстро высыхают и живые объекты на них быстро погибают. Однако есть несколько методических приемов, которые позволяют продлить срок живых объектов на временном препарате. Тогда такие препараты можно хранить не только минуты, но и часы и дни, а при отсутствии постоянных препаратов можно заменить их этими препаратами. Как известно, постоянные препараты требуют для приготовления много времени, реактивы, посуду, термостаты, вытяжку и стоимость таких препаратов довольно высокая. Более того, при использовании их на учебных практических занятиях, они быстро изнашиваются, выцветают

42

или разбиваются. Не каждая школа, вуз может позволить себе закупать постоянные препараты часто и в большом количестве.

Рассмотрим временные препараты из некоторых живых объектов,

изучаемых в школах и вузах, срок использования которых можно было бы продлить.

Перевод временных препаратов в постоянные (Паушева, 1988; Бетехтина,

2008):

1.Наносят расплавленный парафин на краям покровного стекла, покрывающего живые объекты. Это снизит испарение жидкости в течение нескольких недель или месяцев. Можно применить вместо парафина окантовку покровного стекла клеем БФ или лаком для ногтей.

2.Замещают среду, в которой находятся объекты под покровным стеклом,

глицерином. Для этого наносят каплю глицерина около одной из сторон покровного стекла, а на противоположной стороне оттягивают жидкость из под стекла, замещая ее глицерином. Затем окантовывают покровное стекло со всех сторон расплавленным парафином. В этом случае препарат может храниться годами.

3.Осторожно отделяют покровное стекло, стараясь не сдвигать объект, срезы с места, обезвоживают 96% спиртом. Затем обрабатывают бутиловым спиртом,

проводят через ксилол и заключает в канадский бальзам.

4. Еще один метод отделения покровного стела от объекта состоит из следующих шагов. В стеклянную чашку Петри наливают 10%-ю уксусную кислоту, кладут на дно две спички без серных головок. На эти спички вниз покровным стеклом кладут временный препарат, через 10-15 минут покровное стекло отпадает.

Предметное стекло с монослоем опускают в уксусный алкоголь на 45%-й

уксусной кислоте, далее проводят через 96- и 100%-й спирты, ксилол и заключают в канадский бальзам.

5. Постоянные препараты, в частности, содержащие монослой клеток, можно получить сразу раздавливая материал в смеси Гойера. Смесь Гойера состоит из дистиллированной воды (50 мл), гуммиарабик (30 г), чистый глицерин (16 мл),

43

хлоралгидрат (200г). Эту смесь доводят до полного растворения компонентов в дистиллированной воде и отфильтровав хранят в темной банке с притертой пробкой. Смесь Гойера просветляет монослой клеток (объект) благодаря хлоралгидрату и сохраняет клетки длительное время благодаря гуммиарабику.

6.Если необходимо временный препарат оставить неокрашенным достаточно долгое время, то его следует заключать глицерин-желатину. Для окрашенных препаратов эта смесь не годится, так как она обесцвечивает окрашенный объект.

7. Отпечатки органов животных, мазки можно перевести в постоянные препараты. После окрашивания, например, отпечатки можно проведя через батарею спиртов и ксилол довести до заключения в канадский бальзам.

8.Временные живой препарат из слюнных желез можно превратить в постоянный. Слюнные железы мотыля на предметном стекле, находящиеся в изотоническом физиологическом растворе для хладнокровных, накрывают покровным стеклом, обернутым парафильмом (к ней не прикрепляются клетки и ткани). Покровное стекло можно слегка придавить маленьким грузиком (нужно подобрать оптимальную массу) и протягивать фиксатор (например, спирт,

формалин) через препарат. Для этого с одной стороны покровного стекла наносят фиксатор, а с противоположной стороны оттягивают пипеткой или полосками фильтровальной бумаги. Через несколько минут можно снять грузик,

удалить покровное стекло с парафильмом, а предметное стекло погрузить в фиксатор для более продолжительной фиксации. А дальше проводить окрашивание и заключение в бальзам или полистирол. Более подробно эта методика изложена в источнике (Абумуслимов, 1994). Она использовалась для проведения иммуноцитохимического окрашивания лизированных клеток слюнных желез мотыля. Также можно использовать методику приготовления препаратов из эмбрионов на ранних предимплатационных стадиях млекопитающих, например, мыши (Абумуслимов, 1994).

9.Готовый временный давленый цитогенетический препарат можно превратить в постоянный, используя твердую угольную кислоту. Готовый давленый препарат, например, корешков лука помещают на выравненную поверхность

44

сухого льда на 1-1,5 минуты. Клетки в среде замораживаются и затвердевают, а

покровное стекло на поверхности образца становится неподвижным. Поддев

покровное стекло кончиком лезвия или скальпеля, отделяют его от образца.

Клетки при этом должны остаться на предметном стекле. Дальше предметное

стекло с клетками выдерживают в течение 2-5 минут последовательно в 50, 70,

80, 96% растворах этилового спирта, абсолютном спирте, смеси абсолютного

спирта и ксилола и в ксилоле. Наносят каплю канадского бальзама на клетки и

накрывают чистым покровным стеклом. Методику приготовления давленых

цитогенетических препаратов можно посмотреть в источнике (Алиева, 2010).

Методы приготовления временных препаратов из растительных объектов

подробно описаны в источниках (Паламарчук, 1969; Паушева, 1988; Практикум

по цитологии, 1988; Абумуслимов, 2009).

Методы приготовления временных препаратов из животных объектов

описаны в источниках (Абумуслимов, 2009; Абумуслимов, 2013; Шубникова,

1983; Дабагян, 1983, Практикум по цитологии, 1988; Биология, 2013).

Вопросы для самоконтроля:

1.Что собой представляет препарат и для чего он нужен? 2.Как готовится временный и постоянный препарат? 3.Какие виды временных (живых) препаратов бывают? 4.Как можно временный препарат перевести в постоянный? 5.Как долго сохраняются временные препараты?

6.Как долго хранится временный препарат, превращенный в постоянный? 7.Стимулирует ли изготовление временных препаратов школьниками и студентами познавательный процесс школьников и студентов?

8.Насколько важно владеть методами работы с клетками и тканями в век молекулярной и клеточной биологии?

45

Фиксация материала. Полученные кусочки печени быстро переносят в фиксирующую жидкость – фиксатор. Для фиксации можно использовать стеклянные чашки Петри или иную подходящую посуду. Желательно плотно закрываемую посуду, чтобы фиксатор не испарялся, уменьшая объем фиксатора и загрязняя воздух в помещении. Чаще всего для фиксации кусочков используют

10% формалин. Объем фиксатора должен превышать объем, занимаемый кусочком или кусочкам, в 10 раз. Фиксация продолжается в течение 24 часов и более.

После фиксации кусочки материала теперь необходимо освободить от фиксатора. Для этого их промывают в проточной воде до 24 часов. Обычно,

сосуд или чашку Петри с фиксированными кусочками нарывают марлей и ставят под медленную струю проточной воды.

Дегидратация – это обезвоживание промытых от фиксатора водой кусочков, то есть из кусочков удаляют воду. Для этого нужна так называемая гистологическая батарея из спиртов восходящей концентрации в стеклянных цилиндрахс притертой крышкой (Паушева, 1988). Лабораторные стеклянные цилиндры с притертой крышкой исключают испарение и загрязнение воздуха в помещении парами спиртов (метилсалицилат, метилбензонат). Обычно для дегидратации требуется несколько стеклянных цилиндров с разными концентрациями, например, спиртов, а в дальнейшем органических растворителей (ксилола, толуола). Такой ряд проводки из стеклянных цилиндров для удобства называют гистологической батареей или гистологической проводкой.

Вот примерная гистологическая батарея из спиртов для обезвоживания:

-спирт 96% (1 порция для обезвоживания), в течение 24 часов;

-спирт 96% (2 порция для обезвоживания), в течение 2 часов;

-спирт 100% (1 порция), 24 часа;

-спирт 100% (2 порция), 2 часа.

48

(Коржевский, 2010; Микроскопическая техника, 1996; Паушева, 1988). Также следует отметить, что мы приводили схему для мягких тканей (в частности,

печени), а для костной ткани (кости) схема проводки материала может быть иной. Кость сперва нужно размягчить, чтобы можно было резать на срезы.

Поэтому при необходимости можно посмотреть особенности приготовления препаратов из разных тканей в следующих источниках (Микроскопическая техника, 1996; Коржевский, 2010; Меркулов, 1969; Паламарчук, 1969; Мурадов, 2019; Корьяк, 2020; Мавликев, 2020).

Подготовка кусочков материала (печени), пропитанных парафином.

Готовят формочки (кубической формы) из бумаги (Меркулов, 1969). В нее нужно перенести кусочек печени из стакана с парафином (последняя стадия в термостате). Залить формочку с кусочком расплавленным парафином из того же стакана, взятого с термостата или можно взять свежую порцию расплавленного парафина (560). Теперь наш материал оказывается пропитанным парафином.

Подождать пока затвердеет парафин в формочке. Отделяем кубик парафина с кусочком печени от формочки. Его можно теперь прикрепить к деревянному брусочку размерами чуть превышающими размеры формочки (Меркулов, 1969).

Наливают немного расплавленного парафина на поверхность брусочка и прикрепляют к нему залитый в парафин материал из формочки. Брусочек, с

прикрепленным материалом (печенью), в дальнейшем закрепляется в блокодержателе (объектодержателе) санного или ротационного микротома.

Получение срезов на микротоме. Описание разных микротомов и техника резки парафиновых блоков с образцами в частности на санном микротоме дается в руководствах (Меркулов, 1969; Паушева, 1988; Микроскопическая техника,

1996). Проблемы и ошибки, возникающие при изготовлении срезов описаны в источниках (Микроскопическая техника, 1996; Янин, 2015). Обычно толщина гистологического среза в среднем равняется 7-8 мкм. Микротом позволяет настраивать нужную толщину срезов.

Прикрепление срезов к предметному стеклу и их депарафинирование

(удаления парафина). Отдельные срезы или их серию, связанных между собой

50