Методическая разработка по гистологическим методам исследования. Учебно-методическое пособие

двумя обзорными красителями – гематоксилином и эозином – четко дифференцирует ядро (окрашивается гематоксилином в синий цвет) от цитоплазмы (окрашивается эозином в розовый цвет).

Для проведения окрашивания применяется большое разнообразие красителей. Мы рассмотрим наиболее распространенные из них. Окрашивание этими красителями позволяет получить общее представление о морфологии клеток и тканей.

Окрашивание клеток и тканей основано на том, что краситель вступает в химическое взаимодействие с компонентами клеток и тканей. Окрашивание повышает контрастность микроструктур клеток и тканей. Связывание красителя с различными структурами клетки и ткани, позволяет дифференцировать их друг от друга. Как отмечалось выше, неокрашенные клетки и ткани при использовании светового микроскопа, например, изучение объектов методом светлого поля выглядят прозрачными, детали строения плохо выявляются.

Компоненты клетки и ткани по разному связывают красители. На основании чего их делят на кислые, основные и нейтральные. Красители в соответствии с их свойствами связываться по разному с компонентами клетки также делятся на три группы: кислые – связываются с основными компонентами клетки; основные – связываются с кислыми компонентами клетки; нейтральные – связываются с основными и кислыми компонентами.

Структуры клеток и тканей, воспринимающие кислые красители называются ацидофильными или оксифильными. Явления окрашивания кислыми красителями носит название оксифилия или ацидофилия. Структуры,

воспринимающие кислые красители, называют оксифильными. К кислым красителям относятся эозин, эритрозин, оранж, лихтгрюн, конгорот. При окрашивании этими красителями клеток, клеточных структур, тканей, тканевых структур происходит контрастирование их в цвета красного (эозин), оранжевого

(оранж), зеленого (лихтгрюн) и желтого (пикриновая кислота).

Наиболее часто в качестве обзорного кислого красителя используют эозин.

При окрашивании клеток крови, например, цитоплазма эритроцитов эозином

31

окрашивается в красный цвет, гранулы в цитоплазме эозинофилов в красный цвет. Кислые красители окрашивают основные компоненты клеток и тканей.

Структуры клеток и тканей, связывающиеся с основными красителями, по химической природе являются кислыми. В частности, в клетке такими являются нуклеиновые кислоты в составе ядра клеток. Сами окрашивающиеся структуры называются базофильными. Явление окрашивания щелочными красителями носит название базофилии. К основным (щелочным) красителям относят гематоксилин, азур, толуидиновый синий, тионин и метиленовый синий. Эти красители при связывании с кислыми химическими соединениями клетки окрашивают их в синий или фиолетовый цвет. В качестве основного обзорного красителя используют гематоксилин. В клетках крови, печени этим красителем ядра окрашиваются в синий цвет. Так как нуклеиновые кислоты находятся преимущественно в ядре, то чаще всего именно это структура окрашивается базофильно. Кроме того, у некоторых клеток базофильной может быть и цитоплазма. Например, у лимфоцитов, тромбоцитов и моноцитов цитоплазма гематоксилином также окрашивается базофильно, то есть в синий цвет.

Некоторые компоненты цитоплазмы клеток воспринимают как кислые, так и основные красители, их называют нейтрофильными. Окрашивание нейтральных структур в клетках в тканях носит название нейтрофилии.

Примером нейтрального красителя является смесь эозина и гематоксилина или азур с эозином. Эти смеси чаще всего используют в качестве обзорных.

Примером нейтрофилии является окрашивание смесью гематоксилина и эозина цитоплазмы некоторых разновидностей лейкоцитов крови. У некоторых лейкоцитов указанная смесь окрашивает цитоплазму, гранулы в цитоплазме в розовато-фиолетовый цвет.

Метод импрегнации основан на том, что некоторые структуры клеток способны удерживать и восстанавливать соли тяжелых металлов в результате чего они контрастируются, становятся различимыми. В качестве красителей для импрегнации используют соли тяжелых металлов (серебро, свинец, осмий,

32

золото). При импрегнации солями серебра нервных клеток в них хорошо видны аппарат Гольджи, нейрофибриллы.

Окрашенные препараты могут выцветать, поэтому их, обычно, заключают в канадский бальзам. В результате чего окрашенные объекты достаточно длительное время сохраняют свою контрастность. Для краткосрочных целей можно смотреть препараты не заключая их в бальзам или в другую среду.

Перечень некоторых постоянных красителей, применяемых для окрашивания биологических объектов (Грин, 20..?): - анилиновый синий в лактофеноле окрашивает в синий цвет гифы грибов и споры; - борный кармин окрашивает в розовый цвет ядра, главным образом применяется для окрашивания препаратов животного материала, например колонии Obelia; –

гематоксилин окрашивает ядра в синий цвет и применяется для изучения срезов животных тканей и мазков крови в сочетании с эозином, окрашивающим цитоплазму клеток; – краситель Лейшмана окрашивает клетки крови в красно-

розовый цвет, а ядра лейкоцитов – в синий цвет; – краситель Фёльгена окрашивает ДНК ядра в красный или пурпурный цвет, особенно хорошо окрашивает хромосомы во время деления клетки; – метиленовый синий окрашивает в синий цвет ядра клеток, применяют раствор 0,125% метиленового синего в 0,75% в NaCl, можно использовать в качестве прижизненного красителя; – сафранин окрашивает в красный цвет ядра, лигнин и суберин у растений, применяется в основном для изучения срезов растительных тканей совместно со светлым зеленым для окрашивания цитоплазмы клеток; – эозин окрашивает цитоплазму в розовый цвет, целлюлозу в красный цвет, чаще всего используется в сочетании с гематоксилином как обзорный краситель; – светлый зеленый или прочный зеленый окрашивает в цвета зеленого цитоплазму и целлюлозу.

В качестве временных красителей используют: – анилина гидрохлорид или анилина сульфат, который окрашивает лигнин в желтый цвет; – часто применяют раствор йода, окрашивающий крахмал в сине-черный цвет; – раствор Шульца

(хлор+цинк+йод), окрашивает в желтый цвет лигнин, кутин, суберин, белок;

33

крахмал в синий цвет, целлюлозу в синий или фиолетовый цвет; –

флороглюцинол+концентрированная HCl окрашивает лигнин в красный цвет.

Здесь приведены доступные красители, которые можно использовать при

приготовлении простых препаратов.

Арсенал гистологических красителей огромен. Есть специальные

красители, которые избирательно связываются с теми или иными химическими

соединениями в клетке и тканях, например, можно избирательно окрасить белок,

жир, углеводы, РНК и ДНК. Эти методы называются цитохимическими и

гистохимическими. Ознакомиться с этими методами можно в специальных

руководствах. В списке литературы указаны некоторые руководства, в которых

можно найти материал по этим темам (Коржевский, 2010; Луппа, 1980). Есть

методы, которые для изучения морфологии клеток и клеточных структур

используют антитела (Луппа, 1980; Полак, 1987; Михайлов, 1991). Подробно

современные методы клеточной биологи (цитологии) изложены в руководстве,

подготовленном ведущими клеточными биологами из МГУ (Большой практикум, 2021).

Вопросы для самоконтроля:

1.Зачем проводят окрашивание клеток и тканей?

2.Как меняется морфология клеток и тканей после окрашивания?

3.Опишите различия морфологии окрашенных и не окрашенных клеток и тканей?

4.Какие группы красителей по способу химического взаимодействия с компонентами клеток и тканей различают?

5.Раъясните термины оксифилия (ацидофилия, эозинофилия), базафилия, нейтрофилия, метахромазия?

6.Что означает обзорные красители и приведите примеры?

7.Специфические методы окрашивания?

8.Цитохимические, гистохимические и другие методы выявления специфических компонентов клеток и тканей?

34

Глава 3. Методы приготовления временных препаратов клеток и тканей

Для изучения биологических объектов под микроскопом цитологи и гистологии изготавливают препарат. Препарат – прозрачное предметное стекло,

проницаемое для проходящего света, с помещенным на середине его поверхности с клетками или тканью. Как правило, сверху биологический образец

(среда с клетками, тканями или с фиксированными объектами) накрывают прозрачным покровным стеклом. Дело в том, что под световым микроскопом свет (лучи света), направляемый для освещения объекта, должен пройти через объект, попасть в оптическую систему (объектив, окуляр) для получение мнимого увеличенного изображения объекта. Поэтому стекла покровные и предметные, среды для заключения среза, иммерсия должны быть прозрачными и обладать приблизительно одинаковой оптической плотностью.

По длительности сохранения структуры биологического образца (клеток,

тканей) все препараты можно разделить на временные и постоянные. Объекты на временных препаратах не долго сохраняют свою структуру, распадаются и разрушаются, а на постоянных, наоборот, биологические образцы можно длительно хранить и неоднократно изучать под микроскопом.

3.1 Приготовление временных препаратов из клеток и тканей животных и растений

Минимальные требования к условиям для изготовления временных препаратов: предметное стекло, покровное стекло, пинцет для манипуляций с биологическими объектами, пинцет также используется для накрывания объекта на предметном стекле покровным стеклом или препаровальная игла для тех же целей, глазные пипетки для забора биологического материала, находящегося в среде, добавления среды или воды под покровное стекло к объекту, вода, спирт для обезжиривания стекол, фиксации биологического материала, чашки Петри,

световой микроскоп.

35

Обычно приготовление временного препарата можно предварить изучением препаратов приготовленных из мелких твердых объектов. Чаще всего для обучения приготовления временного препарата используют человеческий волос, так как он обладает высокой плотностью и хорошо контрастируется.

Берут волос размером 4 см, разрезают на две равные половинки, кладут их накрест друг на друга в центр предметного стекла, накрывают покровным стеклом. Если пространство между покровным и предметным стеклами вокруг перекреста волос заполнить обычной чистой водопроводной водой, то четкость препарата повысится. Используя это препарат с перекрещенными волосами можно научиться работать со световым микроскопом: изучать препарат на малом и больших увеличениях, настраивать фокус.

При изготовлении временного препарата из живых биологических объектов (бактерий, простейших одноклеточных, некоторых тканей). Техника изготовления временного препарата такая же, как и при приготовлении препарата из волоса.

Приготовление временного препарата с простейшими одноклеточными живыми объектами из воды, взятой с заросшего летнего или весеннего водоема,

или заросшего аквариума:

1.Взять чистые предметное и покровное стекло;

Рис. 4. Схема наложения покровного стекла на объект

36

2.Поместить небольшую каплю воды, взятой глазной или иной пипеткой из водоема, аквариума, в центр предметного стекла. Не забыть воду из водоема или аквариума перед взятием капли встряхнуть. Это повысить концентрацию живых объектов в отбираемой капле жидкости;

3.Как показано на схеме (рис. 4) накрыть каплю осторожно покровным стеклом, постепенно опуская его на каплю раствора с объектами;

4.Излишки жидкости можно оттянуть либо пипеткой, либо фильтровальной бумагой.

5.Препарат готов к изучению под микроскопом методом светлого поля;

6.Изучить этот препарат руководствуясь с вышеописанными правилами работы со световым микроскопом;

7.Попробуйте зарисовать объекты обычным карандашом в альбом и изучить их. Если взята вода из аквариума, то можно увидеть, например,

парамеции (инфузории туфельки), если из крупного водоема, то, возможно,

кроме инфузорий, различных одноклеточных водорослей, можно и увидеть и обыкновенную амебу.

Перечень временных препаратов из живых биологических объектов,

которые можно самостоятельно приготовить и изучить под световым микроскопом довольно большой.

Мы приводим некоторые из них, которые можно приготовить самостоятельно во время практических занятий на уроках биологии в школе или по клеточной биологии, гистологии и эмбриологии в вузе.

Препарат из прокариотических клеток бактерий.

Берут несвежую сыворотку молока. Обычно, дают свежеполученной сыворотке молока постоять один или два дня на открытом воздухе. Далее берут пипеткой каплю этой сыворотки и готовят временный препарат как это описано выше. Наносят каплю сыворотки на предметное стекло. Накрывают покровным стеклом. Изучают под световым микроскопом, следуя правилам изучения препарата под световым микроскопом, описанным выше в этом пособии. На увеличениях с объектовом х40 можно увидеть бактерии палочковидной и

37

округлой формы. На препаратах также можно увидеть дрожжевые грибы

(эукариотические клетки). Можно эти бактерии или дрожжевые клетки с помощью современных смартфонов (телефонов) отснять. При этом можно снять фото или видео. Можно эти клетки зарисовать, глядя левым глазом в окуляр, а

правым глазом, контролируя процесс рисования в альбоме.

Исследование живых объектов из водоема или аквариума.

Для приготовления временного препарата берут воду из стоячего природного водоема или озера. Можно взять воду из заросшего водоема или аквариума. Этот способ в принципе повторяет опыт А. Левенгука, жившего в

17-ом веке. Вода должна быть прозрачной, не сильно мутной, так как в мутной воде живые объекты плохо микроскопируются.

Воду из водоема перед приготовлением препарата нужно взболтнуть.

Берут каплю воды с помощью глазной пипетки. Наносят каплю в центр предметного стекла, накрывают покровным стеклом. Изучают под световым микроскопом под разными увеличениями. Можно увидеть инфузории,

одноклеточные водоросли (хламидоманада, зеленая эвглена, хлорелла),

нитчатые многоклеточные водоросли, бактерии, микроскопические черви и пр.

Если воду для исследования взяли из водохранилища (например, грозненское),

или других больших природных водоемов или из заросшего аквариума, то кроме инфузорий иногда видны амебы. Экспериментатор может отснять с помощью фотокамеры или видеокамеры смартфона объекты, видимые на препарате,

изучить видовой состав, наблюдаемых объектов. Очень интересный и познавательный материал.

Временный препарат из капли крови.

Для приготовления препарата можно взять кровь у лягушки, рыбы или у человека. Если использовать кровь человека, то эта процедура приготовления временного препарата выглядеть следующим образом. Обрабатывается безымянный палец левой руки спиртом, затем прокалывают подушку пальца скарификатором или эту процедуру выполняют с помощью аппарата

(пистолета), используемого для исследования крови на глюкозу. При

38

использовании пистолета операция по взятию капли крови становится более безболезненной, так как там используются ланцеты для прокалывания кожи пальца. Наносят небольшую каплю крови на середину предметного стекла,

осторожно накрывают покровным стеклом. При удачном проведении процедуры покровное стекло равномерно покроет каплю крови и получиться тонкий слой крови. При визуализации препарата под световым микроскопом хорошо видны круглые красные эритроциты (их больше всего в поле зрения) и редко встречающиеся прозрачные лейкоциты. Так как клеток крови много во поле зрения не всегда удается хорошо их изучить. Поэтому можно перед приготовлением препарата нанесенную на предметное стекло каплю крови разбавить физиологическим раствором (0,9% раствор NaCl). Теперь можно хорошо разглядеть отдельные клетки и изучить их морфологию под микроскопом.

Временный препарат из буккального эпителия.

При изготовлении буккального эпителия (эпителиальные клетки многослойного неороговевающего эпителия) поступают следующим образом.

Наматывают стерильную вату на кончик стеклянной палочки или берут стеклянный шпатель. Далее проводят несколько раз, например, стеклянной палочкой с ватным тампоном по внутренней стороне щеки, нажимая на поверхность слизистой оболочки щеки. Затем кончиком ваты на спичке проводят по чистому предметному стеклу, желательно по центру предметного стекла.

Наносите каплю физиологического раствора (0,9 % NaCl) на образец в центре предметного стекла. Накрываете покровным стеклом. При изучении под световым микроскопом можно увидеть плоские эпителиальные клетки полигональной (многоугольной) формы. Хорошо видно ядро клетки, границы клетки, в прозрачной цитоплазме угадываются некоторое количество пузырьков небольшого диаметра (органеллы клетки).

Препарат слюнных желез мотыля. Для его приготовления берут личинки комара. Личинка комара называется мотылем. Готовят или берут готовый физиологический раствор (0,6% NaCl) для хладнокровных животных. Наносят

39

большую каплю физраствора в центр предметного стекла. Помещают в этот раствор мотыль, у которого со стороны головной части на уровне между вторым и третьим сегментом туловища проводят разрыв. При этом в раствор вываливаются достаточно крупные, видимые даже не вооруженным взглядом,

практически прозрачные парные слюнные железы личинки комара. Удобнее эту операцию проводить в стеклянной или пластиковой чашке Петри под бинокулярной лупой. Предметное стекло с раствором при этом помещают в чашку Петри.

После того как слюнные железы выделены и оказываются в центре предметного стекла, их осторожно накрывают покровным стеклом. Излишки раствора можно оттянуть пипеткой, а при необходимости можно заменить слишком грязный физраствор под покровным стеклом. Для этого на одной из сторон покровного стекла ставят полоску из фильтровальной бумаги оттягивая раствор, а на противоположной стороне наносят свежую порцию физраствора.

Теперь препарата можно изучать под световым микроскопом. Даже на маленьких увеличениях микроскопа можно увидеть довольно крупного размера клетки. В огромных ядрах хорошо заметны крупные политенные хромосомы.

Докрашивая раствором метиленовым синим, разведенного в физрастворе для хладнокровных, можно увидеть ядро и политенные хромосомы, окрашенные основным красителем в синий цвет.

Перечень временных препаратов и способы их приготовления, которые могут быть использованы в школах, приведены в источнике (Ашенбреннер,

2018). Вот некоторые методы приготовления временных препаратов: метод

«раздавленная капля»; метод «висячая капля»; метод приготовления бактериального мазка с простым окрашиванием; метод отпечатка.

Методом «раздавленная капля» можно приготовить временные препараты из бактерий, клеток культуры растений, простейших, ряда грибов (дрожжи,

мукор), водорослей и других мелких организмов. Пипеткой наносят каплю среды на середину предметного стекла, например, с бактериями и накрывают покровным стеклом. Немного надавливают сверху покровное стекло, излишки

40