Методическая разработка по гистологическим методам исследования. Учебно-методическое пособие

В таблице 2 представлена маркировка окуляра светового микроскопа. В

основном указываются увеличение окуляра и диаметр видимого поля зрения.

Символ «К» – указывает на устранение аббераций света, прошедшего через линзы объектива.

Таблица 2. Маркировка окуляра

Осветительная часть содержит зеркало для освещения объекта на препарате, конденсор для концентрирования пучка света, идущего от зеркала для подсветки, на объект, препарат. Также к осветительной части можно отнести и ирисовую диафрагму с рычажком для регулирования диаметра отверстия.

Изменяя диаметр отверстия диафрагмы можно регулировать силу света прошедшего через конденсор.

Рис. 4. Конденсор и ирисовая диафрагма светового микроскопа. Слева – ирисовая диафрагма; справа – конденсор

На некоторых микроскопах имеются и специальные выдвижные гнезда для вставки фильтров разного цвета. С помощью них можно пропускать свет определенной длины, который будет освещать объект. Это может незначительно повысить разрешающую способность светового микроскопа. Например использование синего фильтра может снизить разрешающую способность менее,

чем 0,2. мкм. Известно, что разрешающая способность светового микроскопа

определяется длиной волны падающего на объект света. А длина волны синего света около 400 нм, а без фильтра длина волны выше. Современные световые микроскопы имеют электрическое освещение с помощью лампочки, встроенной в основание микроскопа.

Механическая часть выполняет функцию опоры для остальных частей микроскопа и включает основание микроскопа (башмак), предметный столик для размещения препарата, тубус для установки окуляра, револьвер для закрепления объективов разного увеличения, револьвер может вращаться. Сюда же могут быть отнесены винты грубой (макровинт) настройки, тонкой настройки

(микровинт), которые позволяют наводить фокус на исследуемый объект,

увидеть четкое изображение изучаемого объекта.

Увеличения окуляров и объективов указываются на поверхности этих оптических частей микроскопа.

Наиболее распространенные в нашей стране микроскопы: «МБР», «МБИ», «Биолам», «МИКМЕД» «Микромед». Они дают увеличение до 1000-1500 раз.

Увеличение, получаемое в микроскопе, определяют, как произведение увеличений объектива и окуляра.

Современные световые микроскопы имеют намного более улучшенные оптические характеристики.

Правила работы с микроскопом, например, с монокулярным (с одним окуляром) МБР-1. При работе со световым микроскопом необходимо соблюдать несколько правил. Ниже приводится методика работы с микроскопом с зеркалом для освещения препарата. Для работы с микроскопом с электрическим освещением (например, Микромед) имеется ряд отличий, о которых также будет сказано ниже.

Для начала работы с микроскопом МБР-1 необходимо подготовить рабочее место за столом, занять удобную позицию на стуле или в кресле.

Микроскоп необходимо поставить напротив источника света. Зеркало для подсветки при этом должно находится напротив хорошо освещенного места.

Изучение любого объекта начинают с малого увеличения. Поэтому сначала на

22

микроскопе нужно выставить объектив малого увеличения (х8 или х20). Если вначале работы объектив или объективы расположены слишком близко к предметному столику, то надо чуть его приподнять с помощью макровинта.

Далее осторожно поворачиваем револьвер до тех пор, пока выбранный объектив малого увеличения не установится над центральным отверстием предметного столика через которое свет освещает препарат. Показателем того, что объектив установился правильно является щелчок затвора револьвера. Двигая вверх или вниз объектив малого увеличения с помощью макровинта в зависимости от первоначального его положения добейтесь его положения примерно на уровне

0,5 сантиметров над поверхностью предметного столика. Если ирисовая диафрагма закрыта, то не забудьте его приоткрыть и приподнимите, но не до упора. Теперь нужно добиться равномерного освещения поля зрения. Для этого исследователю глядя в окуляр левым глазом необходимо вращать зеркало для подсветки и добиться такого его положение, когда поле зрение будет максимально и равномерно освещено. У зеркала для подсветки имеются две стороны. Вогнутая сторона используется при малом освещении, а при избытке

(яркий свет, солнечный день) – плоскую сторону. Вогнутая сторона собирает лучи света, а плоская рассеивает. Если малая освещенность Теперь можно поставить на предметный столик исследуемым препарат. Препарат (стекло) с

покровным стеклом кверху располагают таким образом, чтобы объект на препарате (стекле) находился прямо над центральным отверстием предметного столика. После размещения на предметном столике препарат нужно закрепить его с помощью зажимов.

С помощью микрометрического винта, зрительно контролируя процесс,

опускаем тубус (объектив) на расстояние 2 миллиметров (0,2 см) от поверхности покровного стекла. Следующий шаг – это фокусирование препарата. Для этого исследователь должен смотреть в окуляр левым глазам, осторожно приподнимать тубус, пока в поле зрения он не увидит объект. Ориентировочно на малом увеличении – это расстояние от поверхности покровного стекла 5 мм

(0,5 см). Осторожно манипулируя макровинтом можно добиться четкого фокуса

23

объекта. Фокусное расстояние для малого увеличения равно приблизительно 0,5

см. Теперь можно исследовать свой препарат: если на препарате отдельные клетки, то можно увидеть общие границы клетки, ядро, как правило,

расположенное в центре, цитоплазму вокруг ядра.

Использования большого увеличения. Если используется объектив с увеличением х40, то это не вызывает затруднение. Прежде чем перейти к работе с большим увеличением необходимо выбрать участок препарата (объекта) на малом увеличении, который нужно в дальнейшем изучать. Он должен быть отцентрирован. Для этого на микроскопах типа МБР-1 препарат приходится центрировать двигая его пальцами рук или используя препаратодвигатели

(винты препаратоводителей), если они есть на микроскопе. Если не отцентрировать объект, то на большем увеличении он окажется вне поля зрения.

Провернув револьвер приводим в рабочее положение объектив с увеличением х40. Далее осторожно с помощью все того же макровинта опускаем тубус примерно до уровня 1 мм над поверхностью покровного стекла препарата. Все это должно происходить под контролем глаза, наблюдая это процесс сбоку, а не глядя в окуляр. Это условие нужно тщательно соблюдать, так как фокусное расстояние на этом увеличении равняется примерно 1 мм. Линза объектива при этом очень близко подходит к покровному стеклу, то есть можно повредить линзу объектива и разрушить препарат. Теперь можно приступить к фокусировке препарата. Наблюдая левым глазом в окуляр нужно макровинтом осторожно поднимать вверх тубус с объективом х40 пока не появится изображение исследуемого объекта. Так как фокусное расстояния для объектива с увеличением х40 приблизительно равняется 1 мм, то его легко можно пропустить. Тогда настройку придется произвести заново. Если объект попал в поле зрения, то для тонкой фокусировки (получения четкого изображения объекта) можно теперь использовать микрометрический винт (микровинт).

Осторожно двигая микровинтом вверх или вниз, примерно на полоборота, при этом глядя в окуляр левым глазом, добейтесь четкого изображения, фокуса.

Теперь можно изучать свой объект. Отметьте для себя, что размеры объектов

24

(клеток, тканей) значительно увеличились, можно заметить больше структурных деталей изучаемого объекта. Наблюдая левым глазом свой объект в микроскоп одновременно можно произвести его зарисовку в альбом, контролируя это процесс правым глазом.

Использование иммерсионного (от лат. immersia - погружать или окунать)

объектива с увеличением х90 требует большой осторожности, так как фокусное расстояние до объекта еще меньше, чем при работе с увеличением х40.

Увеличение х90 позволяет лучше различить структурные компоненты клеток и тканей, увеличивая их размеры. При использовании иммерсионного объектива необходимо между линзой объектива и поверхностью покровного стекла,

покрывающего объект, поместить каплю жидкого вещества, имеющего одинаковый коэффициент преломления со стеклом. То есть коэффициенты преломления линзы, покровного стекла и иммерсионной среды между ними выравниваются. При этом свет проходящий через них меньше рассеивается в однородной среде. В качестве иммерсионной среды используют кедровое масло,

которое имеет сходный со стеклом коэффициент преломления среды.

Чтобы работать с увеличением х90 нужно повторить этапы настройки работы с маленьким увеличением: настроить свет, установить фокус, найти нужный участок препарата, который необходимо в дальнейшем изучать. Далее между линзой объектива и поверхностью покровного стекла необходимо поместить каплю кедрового масла. Переведя с помощью вращения револьвера микроскоп на увеличение объектива х90 опускаем его примерно на расстояние

0,2 см (2 мм). При этом линза объектива с увеличением х90 погрузится в иммерсионную среду (кедровое масло). Всю процедуру настройки визуально контролируют, наблюдая его со стороны, сбоку. До погружения линзы с объективом х90 можно перемещать тубус с объективом, используя макровинт.

Теперь можно начать настройку фокуса. Глядя в окуляр левым глазом, используя только микровинт, осторожно вращая опускаем объектив. Если все шаги выполнены правильно, то должно появится нечеткое изображение объекта на препарате. Теперь можно немного приподнять объектив х90 с помощью того же

25

микровинта, сделав полоборота, для получения четкого изображения объекта.

Последние шаги настройки нужно выполнять очень осторожно, так как фокусное расстояние с объективом х90 еще меньше, чем при использовании объектива с увеличением х40, то есть меньше, чем 1 мм.

При работе с малым и большим увеличениями микроскопа нужно соблюдать несколько правил. Конденсор микроскопа при работе на большем увеличении нужно приподнять до упора, вплоть до предметного стекла препарата с объектом, но не касаться его. Это увеличивает освещение препарата,

объекта. На малом увеличении конденсор нужно несколько опустить вниз, так как слишком высоко приподнятый конденсор будет ярко освещать препарат,

объект и это ухудшает правильную настройку. После окончания работы с микроскопом нужно привести его в нерабочее состояние. Если работали на большом увеличении с иммерсией, то необходимо осторожно приподнять тубус с объективом вверх, перевести на малое увеличение. Кедровое масло на поверхности линзы объектива и покровного стекла осторожно удаляют сухой марлей. Ни в коем случае для удаления масла нельзя линзу объектива протирать марлей, смоченной органическими растворителями (ксилол, толуол и др.).

При необходимости транспортировать микроскоп с рабочего места на место хранения также необходимо выполнить ряд условий: микроскоп при транспортировке нужно держать за тубу содержатель и одновременно поддерживать его за подошву, основание.

Особо следует отметить, что вращение микро- и макровинтами следует выполнять очень осторожно. Грубые и резкие движения могут нарушить юстировку микроскопа. Любые резкие механические действия с микроскопом даже при его транспортировке могут изменить его работу. Следует помнить, что микроскоп является точным прибором.

При неправильном использовании настроек микроскопа можно получить искаженное изображение исследуемого объекта и неправильно интерпретировать результаты наблюдений.

26

Теперь мы рассмотри особенности работы с современными микроскопами с электрической подсветкой, освещением, на примере современного бинокулярного микроскопа (Микромед). Первое отличие – это то, что микроскоп не зависит от внешнего освещения, так как освещение препарата, объекта происходит с помощью электрической лампочки, подключаемой в сеть, а не через зеркало для подсветки. Интенсивность освещения на новых микроскопах регулируется. Второе отличие – на некоторых вариантах микроскопов с освещением, кроме обычных сухих объективов с увеличениями х4, х10 и х40,

имеются водный объектив (водной иммерсией) с увеличением х40 и масляный иммерсионный объектив с увеличением х100. Объектив с увеличением х90 на таких микроскопах отсутствует. Третье отличие – на микроскопах могут быть улучшенная система закрепления препарата и механизм его перемещения.

Четвертое отличие – у объективов устранены различные абберации света, что указывается надписями на них. Эти новшества значительно улучшают работу микроскопа.

Одним из важных условий при работе с бинокулярным микроскопом

«Микромед» – это умение настраивать освещение по Келеру (Мурадов, 2019).

Суть принципа настройки освещения по Келеру состоит в том, что необходимо настроить осветительную систему (источник света, коллектор, конденсор) на одну оптическую ось с собственно оптикой микроскопа, объективом, окуляром.

Для этого имеются две материальные диафрагмы, которые физически мы можем видеть, и виртуальная оптическая ось микроскопа, которую мы не в состоянии увидеть. Две диафрагмы – это полевая диафрагма, установленная на штативе микроскопа вблизи осветителя вблизи осветителя (источника света и коллектора) и апертурная диафрагма, смонтированная внутри конденсора.

Порядок настройки освещения следующий. Сначала настраивают микроскоп на малом увеличении, получают четкое изображение предварительно установленного препарата. Прикрывают полевую диафрагму осветителя. С

помощью фокусировочного механизма конденсора добиваются четкого и резкого изображения краев полевой диафрагмы. Далее с помощью

27

центрировочных винтов конденсора приводят изображение полевой диафрагмы в центр поле видения. Раскрывают полевую диафрагму до размера поля видения.

Открывают апертурную диафрагму конденсора по выходному зрачку объектива и, наблюдая за ярким пятном в микроскопе, открывают апертурную диафрагму в размер этого пятна. Для повышения контрастности изображения нужно открыть апертурную диафрагму на 80% относительно выходного зрачка объектива. Если после настройки все равно появляются блики, произошло снижение контрастности необходимо заново проверить все этапы настройки освещения по Келеру. Все операции необходимо проводить при сфокусированном на препарат микроскопе.

Требования к конденсорам при работе с объективами разных увеличений.

Если работа проводится с объективами х20 и выше, то нужно применять конденсор с числовой апертурой А = 0,9/1,25 (1,4). При работе с объективами х10 и меньше нужен конденсор с числовой апертурой А = 0,3 с линзой большого поля.

Первые этапы настройки микроскопа МБР-1 на малом увеличении и бинокулярного микроскопа на малых увеличениях в основном схожи. Поэтому легко настроить бинокулярный микроскоп на увеличениях сухого объектива х4,

х10, х20 и х40, используя рекомендации описанные выше для МБР-1. Однако,

при работе с современным бинокулярным микроскопом необходимо настраивать освещение по Келеру. Настройка по Келеру описана выше.

Порядок работы с объективом масляной иммерсии следующий.

1.На малом увеличении (объективы: х4, х10, х20) настраивают микроскоп,

получают четкое изображение объекта на препарате;

2.Настраивают освещение по Келеру для работы методом светлого поля. Все операции по настройке освещения выполняют с сухим объективом малого увеличения (4х, х10, 20х);

2.На препарат капают иммерсионное масло; 3.Переводят на большое увеличение (объектив: х100);

4.Опускают объектив до соприкосновения с иммерсионным маслом;

28

5. С помощью рукояток грубой и точной фокусировки настраивают Разновидностей световой микроскопии очень много. С правилами работы,

с которыми можно ознакомиться в соответствующих руководствах. При закупке микроскопа в комплект входят руководства с техническим описанием и инструкциями по эксплуатации. Также руководства к микроскопам можно найти в сети Интернет. В списке литературы приводится руководство по работе с микроскопом из серии Микромед (Микромед-3). В этом руководстве подробно описаны оптическая, осветительная и механические части микроскопа, дано описание характеристик объективов, окуляров и конденсоров, приводятся правила работы с микроскопом, в том числе, настройка освещения по Келеру.

Электронная микроскопия позволяет изучать ультраструктура клеток и тканей. Если обычная световая микроскопия, использующая дневной свет или освещение от электрической лампочки, позволяет видеть структуры с размерами от 0,2 мкм, то с помощью электронного микроскопа можно видеть более мелкие структурные компоненты клеток. Как уже отмечалось, разрешающая способность электронного микроскопа для биологических объектов равняется

1-2 нм.

Исследование ультраструктуру клеток и тканей с помощью электронной микроскопии является неотъемлемой частью знакомства с уровнями организации живой материи.

Электронный микроскоп в принципе состоит из тех же функциональных частей, что и световой микроскоп (Уикли, 1975; Миронов, 1994). В электронном микроскопе в качестве источника света используется пучок электронов, который пропускается через клетки, клеточные структуры.

Электронно-микроскопические исследования являются важной частью практической и самостоятельной работы студентов. Электронные микрофотографии в настоящее время приводятся в школьных учебниках и в олимпиадных заданиях по биологии. Поэтому умение понимать и интерпретировать ультраструктуру клеток и тканей важно для подготовки современного школьника и студента.

29

Более подробно о методах приготовления препаратов и их изучении,

основах световой и электронной микроскопии можно ознакомится в

руководствах (Аппельт, 1959; Уикли, 1975; Миронов, 1994; Ченцов, 1995;

Ченцов, 2010).

Вопросы для самоконтроля:

1.Назовите уровни организации живой материи?

2.Назовите средние размеры прокариотических и эукариотических клеток?

3.Сравните прокариотические и эукариотические, растительные и животные клетки?

4.Какие структурные компоненты клеток и тканей важны при изучении морфологии этих объектов?

5.Какие единицы измерения используют для описания размеров клеток и тканей? 6.Какую часть метра составляют 1 нм, 1 мкм?

7.Разрешающая способность светового и электронного микроскопов?

8.Во сколько раз увеличивает световой микроскоп?

9.Во сколько раз увеличивает электронный микроскоп?

10.Назовите размеры некоторых клеточных структур, выявляемых под световым микроскопом?

11.Приведите размеры некоторых клеточных структур, видимых только под электронным микроскопом?

12.Что показывает числовая апертура?

13.Какие обозначения наносятся на объективы и окуляры?

14.Что означают цифровые, буквенные и символические обозначения, наносимые на объективы, окуляры и конденсоры?

15.Как настраивают освещение светового микроскопа по Келеру? 16.Как определяют увеличение светового микроскопа?

2.2 Методы окрашивания клеток и тканей

Многие биологические объекты, исследуемые под световым микроскопом,

практически мало поглощают проходящий через них свет. Поэтому под

микроскопом они выглядят прозрачными и в них практически не видны

структурные особенности, детали строения. Для того, что преодолеть это

препятствие проводят окрашивание биологического объекта. Окрашивание

биологического объекта (клеток, тканей, межклеточного вещества) приводит к

контрастированию его структуры, структурных компонентов. Они становятся

видимыми и отличными друг от друга. Например, окрашивание клетки (крови)

30