1.3. БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ФЛАВОНОИДОВ В РАСТЕНИЯХ
Флавоноиды участвуют в пигментации растений и могут определять окраску цветов. Онииграютзаметную роль впроцессахклеточной сигнализации и сами могут служить в качестве мессенджеров химическихсигналов,участвуютвпроцессахрепродукциирастений и, в частности, в процессах развития и функционирования пыльцы, накоплении нектара, в созревании плодов и семян. Новые данные позволяют предположить, что флавоноиды могут участвовать в процессах экспрессии генов, изменять активность регуляторных белков и участвовать в регуляции клеточного деления. Однако наиболее заметную роль флавоноиды играют в защите растений от различных неблагоприятных факторов окружающей среды. К ним следует отнести действие ультрафиолета, температурный стресс, повышенные концентрации тяжелых металлов. Флавоноиды играют огромную роль взащите растенийотбактериальной, вируснойи грибковой инфекции; проникновения паразитов и повреждения насекомыми. Одной из наиболее заметных функций флавоноидов является их участие в защите растений от окислительного стресса благодаря выраженной антиоксидантной активности.
1.4. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЛАВОНОИДОВ
Большинство флавоноидов – твердые кристаллические вещества с определенной температурой плавления, не имеющие запаха.
Окрашены в желтый цвет (флавоны, флавонолы, халконы, ауроны) или бесцветные (катехины, лейкоантоцианидины, флаваноны, изофлавоны). Наиболее яркие оттенки свойственны антоцианам, которые придают растительным тканям красную или синюю окраску в зависимости от рН среды. В кислой среде они имеют красный цвет (соли катионов), в щелочной – синий (соли анионов).
Гликозиды (содержащие более трех остатков сахара) растворимы в воде, водно-спиртовых смесях, в спиртах при нагревании, этилацетате и нерастворимы в органических растворителях (петролейном и диэтиловом эфирах, дихлорэтане, ССl4).
12
Агликоны хорошо растворимы в низших спиртах (метиловом и этиловом), органических растворителях (диэтиловом эфире, ацетоне, бензоле) и в растворах щелочей. Нерастворимы в воде. Глико- зидыобладаютоптическойактивностью.О-гликозидыпридействии разбавленных минеральных кислот и ферментов легко гидролизуются до агликона и углеводного остатка. С-гликозиды с трудом расщепляются под действием концентрированных кислот (HCl или СН3СООН) или их смесей при длительном нагревании.
Катехины и лейкоантоцианидины, как правило, гликозидных форм не образуют. Они легко окисляются в присутствии кислорода, под действием света и щелочей. Остальные флавоноиды более устойчивы к окислению.
Флавоноиды флуоресцируют в УФ-свете: при этом флавоны, флавонол-3-гликозиды, флаваноны, халконы обнаруживаются на хроматограммах в виде коричневых пятен, флавонолы и их 7-глико- зиды – в виде желтых или желто-зеленых пятен.
Свободная ОН-группа седьмого положения способна диазотироваться.
Благодаря карбонильным и фенольным оксигруппам флавоноиды способны образовывать комплексы с солями металлов различной степени устойчивости.
Флавоноиды способны восстанавливатьсяатомарным водородом в кислой среде в присутствии магния или цинка.
Флавоноиды взаимодействуют со щелочами с образованием фенолятов желтой окраски, которая при нагревании изменяется до оранжевой или коричневой.
1.5.ОБНАРУЖЕНИЕ ФЛАВОНОИДОВ
ВЛЕКАРСТВЕННОМ РАСТИТЕЛЬНОМ СЫРЬЕ
Для выделения флавоноидов из сырья проводят экстракцию одним из подходящих растворителей: этанолом, метанолом, горячей водой или спиртоводной смесью.
Для обнаружения флавоноидов в лекарственном растительном сырье (ЛРС) используют химические реакции и хроматографию. Химические реакции подразделяются на цветные и осаждения.
13
Цветные реакции
1. Специфической реакцией на флавоноиды являетсяцианидиноваяпроба(проба Шинода),основаннаяна восстановлениикарбонильной группы атомарным водородом в кислой среде в присутствии металлического магния и образовании антоцианидинов. Продукты восстановления флавонов имеют окраску оранжевую; флаванолов, флаванонов – красно-фиолетовую. При использовании цинка положительную реакцию дают флаванолы и флаванол-3-гликозиды, а флаванонынедаютее.Цианидиновуюреакциюнедаюттакжеизофлавоны, неофлавоноиды, халконы и ауроны. Халконы и ауроны образуют красное окрашивание при добавлении концентрированной хлористоводородной кислоты за счет образования оксониевых солей(рис. 4).
Рис. 4. Цианидин хлорид
Цианидиновая реакция по Брианту позволяет определить агликоновую или гликозидную природу исследуемого вещества. К окрашенному раствору продукта цианидиновой реакции прибавляют равный объем н-октанола (или бутанола), разбавляют водой до разделения слоев и встряхивают. Гликозиды остаются в воде, а агликоны переходят в слой органического растворителя.
2. В реакции со щелочами (аммиаком) флавоноиды дают различную окраску от желтой до коричневой; халконы и ауроны со щелочами – красное окрашивание или ярко-желтое; антоцианидины – синее окрашивание.
3. Флавоноиды благодаря карбонильным и фенольным оксигруппам способны образовывать комплексы с солями металлов:
14
•с хлоридом окисного железа (III) флавоноиды образуют комплексы, окрашенные в различные цвета в зависимости от структуры (от зеленого до коричневого цвета);
•при борно-лимонной реакции 5-оксифлавоны и 5-оксифлаво- нолы взаимодействуют с борной кислотой в присутствии лимонной (или щавелевой), образуя комплекс ярко-желтого окрашивания с
желто-зеленой флуоресценцией в УФ-свете;если флавонол илифлавон не содержит гидроксил в пятом положении, то реакция протекает за счет гидроксила третьего положения (рис. 5);
Рис. 5. Борно-лимонная реакция гидроксила третьего положения
• при реакции с треххлористой сурьмой 5-оксифлавоны и 5-оксифлавонолы, взаимодействуя с треххлористой сурьмой, образуют комплексные соединения, окрашенные в желтый или красный цвет (рис.6);
Рис. 6. Реакция с треххлористой сурьмой
•многие флавоноиды дают окрашенные комплексыжелтого цвета
с5%-нымспиртовым раствором алюминия хлорида, с 2%-ным спиртовым раствором циркония хлорида; флавоноиды, имеющие две оксигруппы у С3 и С5, дают хелаты желтого цвета за счет образования
водородных связей между карбонильной и гидроксильными группами (рис. 7).
15
а |
б |
Рис. 7. Окрашивание в желтый цвет:
а– 5 %-ным спиртовым раствором алюминия хлорида;
б– 2 %-ным спиртовым раствором циркония хлорида
4.Флавоноиды со свободной 7-оксигруппой вступают в реакцию
ссолями диазония, образуя оранжевые или красные продукты азосочетания.
Реакции осаждения
Все флавоноиды с основным ацетатом свинца образуют осадки, окрашенные в ярко-желтый или красный цвет.
Средним ацетатом свинца осаждаются лишь флавоноиды, содержащие свободные орто-гидроксильные группы в 3'-4'-положениях кольца В.
Хроматографические методы
Для идентификации и разделения флавоноидов широко используют хроматографические методы: на бумаге (БХ), в тонком слое (ТСХ) и газожидкостную хроматографию (ГЖХ).
Обнаружение флавоноидов на хроматограммах проводят:
•по окраске пятен в видимом свете (антоцианы);
•по характеру свечения в УФ-свете – флавоны, флавонол-3-О- гликозиды, флаваноны и халконы обнаруживаются в виде темно-ко-
ричневых пятен, флавонолы и их 7-О-гликозиды – в виде желтых или желто-зеленых;
16