Физиология устойчивости растений. Учебно-методическое пособие

Ход работы. Из корнеплода красной свеклы скальпелем или пробочным сверлом нарезать одинаковые по размеру брусочки ткани 1,5–2 см длиной и 4 –5 мм толщиной. Брусочки ткани тщательно промыть под струей воды или в кристаллизаторе с водой для удаления сока поврежденных клеток. Поместить по 1 –2 бруска в 3 пробирки, снабженные этикетками.

В 1-ю пробирку налить на 2/3 воды, во 2 -ю – столько же 0,5 М раствора сахарозы, в 3-ю – 1,0 М раствора сахарозы и выдержать 10–15 минут.

Поместить в большую металлическую емкость (кастрюлю) кристаллизатор и обложить его со всех сторон сухими опилками. В кристаллизаторе приготовить охладительную смесь: к 3 частям снега или кусочков льда добавить 1 часть поваренной соли и тщательно перемешать, контролируя температуру снижения до – 10–150С. Погрузить все пробирки в охладительную смесь и накрыть уплотненной ватой. Через 15–20 минут пробирки поставить в стакан с холодной водой для медленного оттаивания. После оттаивания встряхнуть и отметить степень окраски жидкости в пробирках и окраску срезов. Проверить жизнеспособность клеток получением плазмолиза в 8 % растворе NaCI.

71

Примечание. Часто в варианте с чистой водой при замерзании лопается пробирка. Необходимо осторожно вмерзший брусок свеклы вместе со льдом перенести в целую пробирку.

Сделать тонкие срезы тканей из каждого варианта, поместить на предметное стекло в каплю 8 %-ного NaCl и подсчитать количество живых плазмолизированных клеток, из общего количества клеток в поле зрения микроскопа при малом увеличении, и выразить их в процентах. В выводах объяснить различия между вариантами, отметив значение сахара как криопротектора, повышающего морозостойкость клеток и обратить внимание на степень замерзания растворов.

Работа 10. Определение содержания флавоноидов в растительных тканях

Оборудование и реактивы: эппендорфы на 2 мл;

микропипетки на 100 и 1000 мкл; центрифуга; термостат; спектрофотометр; высушенные до воздушно-сухого состояния листья растений; дистиллированная вода; 95%-ный этиловый спирт; 2 %-ный спиртовой раствор хлорида алюминия; ледяная уксусная кислота.

Ход работы. Высушенные в темноте при комнатной температуре листья растений размалывают в фарфоровой ступке. 50 мг гомогената помещают в 2 мл эппендорфы, добавляют 1 мл 96%-ного этанола. Выдерживают 30 мин в термостате при температуре +45°С. После этого центрифугируют при 13400 об./мин в течение 5 мин. В полученных этанольных экстрактах определяют содержание флавоноидов.

К 60 мкл этанольного экстракта в 1,5 мл эппендорфы поочередно добавляют: 60 мкл 96 %-ного этанола; 120 мкл 2 %-ного спиртового раствора хлористого алюминия

72

(AlCl3); 1,26 мл 96 %-ного этанола. Выдерживают 30 мин. Для определения содержания флавоноидов используют спектрофотометр (поглощение при 415 нм). Раствор сравнения содержит – 60 мкл экстракта; 60 мкл 96 %-ного этанола; 120 мкл дистиллированной воды; 10 мкл ледяной уксусной кислоты; 1,25 мл 96 %-ного этанола.

Содержание флавоноидов рассчитывают по формуле:

С = (А415*k*P*Vэ) / (1000*m),

где:

С – содержание флавоноидов, мг/г сухой массы; А415 – оптическая плотность при длине волны 415 нм; k – пересчетный коэффициент (по рутину);

P – разведение;

Vэ – объем раствора в эппендорфе, мл; m – масса навески, г.

Работа 11. Определение активности гваяколовой пероксидазы

Оборудование и реактивы: фотоэлектроколори-

метр; листья растений или корнеплоды; центрифуга; фарфоровые ступки с пестиками; химические стаканы; колбы мерные на 50 мл; пипетки на 1, 2 и 5 мл; мерные цилиндр на 10 мл; 1/15 М фосфатный буфер, рН 6,7; стандартный раствор пирогаллола, 3 %-ный раствор пероксида водорода.

Ход работы. Навеску листьев растений или корнеплодов (1 г) растирают в ступке с 3–5 мл 0,05 М фосфатного буфера рН 6,7 и переносят в центрифужные пробирки. После настаивания в течение 5–10 мин с периодическим помешиванием вытяжку центрифугируют при 8000 об/мин 10 минут. Надосадочную жидкость (супернатант) используют для определения активности фермента.

73

В контрольную кювету приливают 4,40 мл 0,05 М фосфатного буфера рН 6,7, 0,5 мл раствора пирогаллола (31,5 мг/10 мл воды), хорошо перемешивают и, добавив 0,10 мл 3%-ной пероксида водорода, включают секундомер. В отмеченные отрезки времени (через 10 сек) снимают показания величины поглощения при длине волны 430 нм. В опытную пробу вначале добавляют ферментный экстракт, буфер, пирогаллол и, тщательно перемешав, начинают реакцию пероксидом водорода, поступая так, как описано для контрольной пробы. Полученные результаты по изменению поглощения во времени используют для определения активности пероксидазы и выражают в мкмоль субстрата на 1 г сырой массы. Для расчётов используют миллимолярный коэффициент экстинкции образующегося в ходе реакции пурпурогаллина, равный

2,47 /мМ*см.

Таблица 3

Состав реакционной смеси для определения активности пероксидазы

Работа 12. Определение активности каталазы

Оборудование и реактивы: образцы свежих расте-

ний; фарфоровая ступка с пестиком; пипетки на 1, 2 и 5 мл; весы с разновесами; 1/15 М фосфатный буфер, рН 6,8; мо-

74

либдат аммония 40 г/л, 3 %-ный раствор пероксида водо-

рода (Н2О2).

Ход работы. Определение активности каталазы проводят спектрофотометрическим методом, основанным на образовании окрашенного продукта между перекисью водорода и молибденовокислым аммонием (Goth, 1991). Для этого навеску листьев (100 мг) растирают в ступке с 10 мл фосфатного буфера рН 6,8. Полученный экстракт центрифугируют при 10000g в течении 5 минут.

Реакционная смесь общим объёмом 4,5 мл содержит 0,05 М фосфатный буфер (1,8 мл), перекись водорода в конечной концентрации 9,8 мМ (0,5 мл) и экстракт (0,2 мл). Через 1 минуту в среду добавляли молибд еновокислый аммоний (2 мл). После перемешивания смесь колориметрируют в спектрофотометре при 405 нм.

В качестве контроля (К) используют смесь буфера (2,5 мл) и молибдата аммония (2 мл).

Контроль на взаимодействие реагентов (Ко) содержит буфер (2 мл), перекись водорода (0,5 мл) и молибдат аммония (2 мл). Расчёты проводят по калибровочному графику или по модифицированной формуле:

Е/мл = [(Ко – Оп) / К]*132,2 ,

где Е – число единиц фермента; Ко – оптическая плотность контроля на реагенты; Оп – оптическая плотность опытного раствора; 132,2 – коэффициент пересчёта.

Работа 13. Определение активностиаскорбатпероксидазы

Оборудование и реактивы: K/Na-фосфатный буфер

(рН 7,8), 1 мМ раствор ЭДТА, 10 мМ аскорбат натрия, центрифуга, спектрофотометр, 3% раствор перекиси водорода.

75

Ход работы. Для определения активности аскорбатпероксидазы используют реакцию восстановления пероксида водорода аскорбатом. Для получения грубого ферментного препарата АПО навеску растительного материала (0,5 г) гомогенизируют в 4 мл охлажденного 50 мМ K/Na-фосфатного буфера (рН 7,8), содержащего 1 мМ ЭДТА и 10 мМ аскорбата натрия. Гомогенат центрифугирируют при 10000 g в течение 15 мин при 4°С. Активность аскорбатпероксидазы определяют по кинетике потребления аскорбата, регистрируя изменения оптической плотности при 290 нмв течение1 мин (ε = 2,8 /(мМ*см)). Реакционная среда содержала 50 мМ K/Na-фосфатного буфера (рН 7,8), 1 мМ ЭДТА, 1 мкМ H2O2 и 50 мкл грубого ферментного препарата.

76

ЛИТЕРАТУРА

1.Бухарина, И. Л. Биохимия растений: Учеб.-метод. пособие / И. Л. Бухарина, О. В. Любимова. – Ижевск: ФГОУ ВПО Ижевская ГСХА, 2009.

2.Биологическая химия: Учеб. пособие / Ю. Б. Фи-

липпович [и др.]; ред. Н. И. Ковалевская. – М.: Академия, 2009.

3.Жуков, Н. Н. Биохимия и молекулярная биология: Учеб.-метод. пособие / Н. Н. Жуков, В. В. Иванищев. – Изд-во ТулГУ им. Л. Н. Толстого, 2015.

4.Иванищев, В. В. Продукционный процесс у расте-

ний и его регуляция / В. В. Иванищев. – Тула: Изд-во ТГПУ им. Л. Н. Толстого, 2011.

5.Комов, В. П. Биохимия / В. П. Комов, В. Н. Шведо-

ва. – М.: Дрофа, 2008.

6.Кошкин, Е. И. Физиология устойчивости сельско-

хозяйственных культур / Е.И. Кошкин. – М.: Дрофа, 2010.

7.Панкратова, Е. М. Практикум по физиологии растений с основами биологической химии: Учеб. пособие / Е. М. Панкратова. – М.: КолосС, 2011.

8.Сальников, А. И. Физиология и биохимия растений: практикум / А. И. Сальников, И. Л. Маслов // М-во

с.-х. РФ, ФГБОУ ВПО Пермская ГСХА. – Пермь: Изд-во ФГБОУ ВПО Пермская ГСХА, 2014.

9.Физиология и биохимия сельскохозяйственных растений / Под ред. Н. Н. Третьякова. – М.: КолосС, 2005.

10.Хелдт, Г. В. Биохимия растений / Г. В. Хелдт. –

М.: БИНОМ, 2011.

77