Физиология устойчивости растений. Учебно-методическое пособие

ГЛАВА IX. ЛАБОРАТОРНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ

Работа 1. Тесты на прорастание семян

Теоретический минимум. Условия внешней среды значительно влияют на прорастание семян. Это отражается на дальнейшем протекании онтогенеза и формировании общей и хозяйственной продуктивности растений. При этом изменения в энергии прорастания и всхожести семян часто не столь значительны, как нарушения физиологических процессов и биохимических реакций проростков, поскольку первые характеристики обусловлены использованием веществ, запасённых в семени. Тем не менее, такие тесты позволяют оценить устойчивость процессов формирования ювенильных растений в условиях воздействия конкретного фактора среды.

Оборудование и реактивы: семена растений, чашки Петри; аналитические весы; дистиллированная вода; термостат, химическая посуда (стаканы, цилиндры мерные, колбы).

Ход работы. Семена промывают и обеззараживают раствором пероксида водорода, перманганата калия или иного антисептика. Затем промывают дистиллированной водой и выкладывают на бумагу (лучше – фильтровальную). В чашки Петри раскладывают равное количество (по 20–50 семян). В колбе готовят раствор поваренной соли, тяжелого металла или иного вещества, исходя из предполагаемых концентраций, которые могут находится в растворе в реальной ситуации или в явном избытке.Напр., концентрацию хлорида натрия можно принять примерно равной по засолению морской воды (3,5 %), соли тяжелого металла– 1–5 мМ.

В контрольную чашкуПетри с семенами заливают 20 мл дистиллированной воды, в опытные – по 20 мл раствора

61

соли (вещества) и ставят в термостат для прорастания. В соответствии с ГОСТ определяют, на какой день следует определять энергию прорастания и всхожесть семян. И в эти дни проводят подсчеты. Результаты обрабатывают и делают выводы.

Вариант 2. Полученные проростки пересаживают на воду или соответствующую среду и выдерживают еще в течение 5–7 дней. После этого проводят измерения длины главного корня, побега, определяют их сырую массу. Если экспериментального материала достаточное количество, можно его высушить до воздушно-сухого состояния при температуре 80–105 оС и определить образование сухого вещества в условиях эксперимента.

Вариант 3. Вместо влияния веществ можно использовать влияние температурных условий. В этом случае семена во всех чашках Петри заливают дистиллированной водой. Контрольную оставляют при комнатной температуре, а опытные, напр., в холодильник. Определяют энергию прорастания и всхожесть. Аналогично можно работать с проростками. Если изучают влияние повышенной температуры следует смотреть за испарением воды и добавлять ее по необходимости.

Работа 2. Определение содержания воды

Теоретический минимум. Влияние условий внеш-

ней среды на прорастание семян, в первую очередь, определяется поглотительной способностью воды в условиях эксперимента. Поэтому еще один вариант работ может состоять в определении поглощения семенами воды из раствора за определенный период времени – 1–3 суток.

Оборудование и реактивы: семена растений, чаш-

ки Петри; аналитические весы; дистиллированная вода;

62

термостат, химическая посуда (стаканы, цилиндры мерные, колбы).

Ход работы. Семена промывают и обеззараживают раствором пероксида водорода, перманганата калия или иного антисептика. Затем промывают дистиллированной водой и выкладывают на бумагу (лучше – фильтровальную). Отбирают партии по 20–50 семян промокают их фильтровальной бумагой и взвешивают. Взвешенные партии раскладывают в отмеченные чашки Петри В контрольную чашку Петри наливают 20 мл дистиллированной воды. В опытную – 20 мл раствора исследуемого вещества. Через 1–3 дня семена вынимают, промывают и высушивают при 103–105о С до постоянной массы. Результаты используют для определения содержания воды в семенах и влияния на этот показатель условий прорастания.

Вариант 2. В дистиллированной воде проращивают несколько десятков семян растения. Затем (после появления всходов) их пересаживают на питательную среду. В контроле - только питательная среда, в опыте - питательная среда плюс фактор (хлорид натрия, соль тяжелого металла, гербицид и т.п.). В этом случае учет ведут только для определения сформированных размеров органов и их биологической массы. После высушивания можно определить сухую массу и содержание воды в проростках.

RWC = (FW– DW) × 100/FW,

Где RWC = относительное содержание воды, FW – сырая масса, DW – сухая масса.

На основании полученных результатов делают выводы о влиянии фактора на процессы формирования проростков, размеров органов содержание воды, образование сухого вещества.

63

Работа 3. Определение образования радикальных форм кислорода в клетках

Теоретический минимум. Образование анион-

радикала (О2•-) происходит в ФС I и II хлоропластов и на комплексах дыхательной цепи в митохондриях, а также в ряде реакций, протекающих в пероксисомах (при окислении ксантина ксантиноксидазой). Метод основан на цветной реакции окислительного превращения адреналина в адренохром. Учитывая то, что наиболее стабильным из свободных радикалов является супероксидный анионрадикал О2•-, правильным будет считать, что именно он вносит наибольший вклад в образование адренохрома и в наибольшей степени определяется цветной реакцией с адреналином.

Оборудование и реактивы: штатив с пробирками;

фарфоровая ступка с пестиком; пипетки на 1, 5 и 10 мл; аналитические весы; фотоэлектроколориметр; центрифуга; центрифужные пробирки; источник света (диапроектор); дистиллированная вода; 5,6 мМ раствор адреналина.

Ход работы. 300 мг измельченного растительного материала (листья или корни) гомогенизируют с 10 мл дистиллированной воды. После этого полученный гомогенат центрифугируют 20 мин при 4000 g. По 3 мл супернатанта переносят в чистые пробирки. В одну из пробирок добавляют 100 мкл 5,6 мМ адреналина (до конечной концентрации 0,18 мМ), в другую – 100 мкл воды. Затем пробирки оставляют на 30 мин при температуре 22°С на слабом свету (2 клк), после чего измеряют оптическая плотность раствора с адреналином против раствора с дистиллированной водой при длине волны 480 нм, используя кюветы с длиной оптического пути 1 см.

64

Скорость генерации супероксид-аниона рассчитывают по формуле:

V = ΔD / t,

где:

V – скорость генерации супероксидного анионрадикала, отн. ед. (1отн. ед. = 10 -3 опт.ед./мин);

ΔD – разница поглощения между гомогенатом с адреналином и гомогената с водой;

t – время инкубации, мин.

Работа 4. Определение содержания пероксида водорода

Оборудование и реактивы: штатив с пробирками;

фарфоровая ступка с пестиком; центрифуга; центрифужные пробирки; аналитические весы; фотоэлектроколориметр; 100 %-ный раствор ацетона; 20 %-ный раствор хлорида титана (IV); концентрированный раствор аммиака; 1М раствор серной кислоты; стандартные растворы пероксида водорода в 100 %-ном ацетоне (0,1–1,0 мМ).

Ход работы. 1 г замо роженных листьев измельчают и растирают с 5 мл холодного 100 %-ного ацетона в фарфоровой ступке. После этого полученный гомогенат центрифугируют 20 мин при 12000 g. 1 мл полученного супернатанта смешивают с 0,1 мл 20%-ного TiCl4 и 0,2 мл концентрированного раствора NH4OH. В результате этого образуется титан-пероксидный комплекс. Раствор вновь центрифугируют 20 мин при 12000 g. После центрифугирования осадок трижды промывают холодным ацетоном, чтобы удалить пигменты, а затем растворяют в 3 мл 1 M H2SO4. Абсорбция титан-пероксидным комплексом измеряется на спектрофотометре при 420 нм.

Для определения количества перекиси водорода строится калибровочная кривая с использованием опреде-

65

ленных концентраций H2O2 в 100 %-ном ацетоне (от 0,1 мМ до 1 мМ). После этого по величине абсорбции и калибровочному графику определяют концентрацию пероксида водорода, которую выражают в моль/г. сырой массы.

Работа 5. Определение интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ)

Оборудование и реактивы: штатив с пробирками;

фарфоровая ступка с пестиком; водяная баня; термостат; аналитические весы; центрифуга; центрифужные пробирки; спектрофотометр; пипетки на 1, 5 и 10 мл; растительный материал (листья и др.); 0,1% -ный раствор трихлоруксусной кислоты; 0,5 %-нй раствор тиобарбитуровой кислоты в 20 %-ном растворе трихлоруксусной кислоты.

Ход работы. Образцы листьев (0.5 г) гомогенизируют с 10 мл 0.1%-ной ТХУ в фарфоровых чашках. После этого полученный гомогенат центрифугируют при 15000 g в течение 5 мин. К 1 мл полученного суперна танта добавляют 4 мл 0.5 %-ной тиобарбитуровой кислоты в 20 %-ной ТХУ. Смесь нагревают 30 мин при 95°С в термостате и быстро охлаждают в ледяной бане для остановки реакции. Полученный раствор центрифугируют при 10000g в течение 10 мин. На спектрофотометре при длине волны 532 нм и 600 нм измеряют оптическую плотность полученного супернатанта.

Эквиваленты МДА подсчитывают по следующей формуле:

с = ((А532 – А600) / 155000)х106,

где:

с – концентрация МДА, нмоль/г сырого веса; А532 – оптическая плотность раствора при 532 нм;

А600 – значение неспецифического поглощения МДА при 600 нм.

66

Работа 6. Количественное определение пролина в растительной ткани

Оборудование и реактивы: свежие листья растений

(горох, фасоль и др.); пробирки с притертыми пробками; водяная баня; воронки, фильтровальная бумага; термостат; химические стаканы на 50 мл; спектрофотометр; нингидриновый реактив (1,24 г нингидрина, 30 мл ледяной уксусной кислоты и 20 мл 6 М ортофосфорной кислоты); толуол; стандартный L-пролин (0,01–0,2 мМ).

Ход работы. Навеску свежих листьев (250 мг) помещают в закупоренные пробирки с 10 мл дистиллированной воды. Пробирки помещают в водяную баню для горячей экстракции водорастворимых соединений в течение 1 часа при 90°С.

После этого полученный экстракт отфильтровывают и 1 мл фильтрата смешивают с 2 мл нингидринового реактива и 2 мл ледяной уксусной кислоты. Полученную смесь инкубируют 1 час при 96°С в термостате. Реакцию останавливают, помещая пробирки в холодную воду. Охлажденный раствор смешивают с 3 мл толуола. После настаивания в течение 10 минут при встряхивании толуольную фазу декантируют. Оптическую плотность полученного раствора измеряют при 520 нм на спектрофотометре.

Содержание пролина определяют по калибровочной кривой, построенной со стандартным L-пролином в диапазоне концентраций 0,01–0,2 мМ., и выражают в мг/г сырой массы.

67

ной кислотой и через 10 минут учитывают степень повреждения листа по количеству появившихся бурых пятен. Результаты записывают в таблицу, обозначив отсутствие побурения знаком «–», слабое побурение – «+», побурение более 50 % площади листа – «+ +» и сплошное побурение –

«+ + +».

Оцените степень жаростойкости исследованных растений.

Работа 8. Определение солеустойчивости растений

Оборудование и реактивы: семена томата, огурца,

кукурузы, подсолнечника и др.; приготовленные растворы NaCI с различным осмотическим давлением: 2,0; 4,0; 6,0; 8,0; 10 атм. (0,28; 0,57; 0,85; 1,12; 1,4 г NaCI на 100 мл, со-

ответственно); дистиллированная вода, стерильные чашки Петри с фильтровальной бумагой, ножницы, пипетки или мерные цилиндры на 10 мл, маркер по стеклу, термостат, сушильный шкаф, дистиллированная вода.

Ход работы. В чашки Петри поместить кружочки фильтровальной бумаги и простерилизовать сухим жаром в сушильном шкафу при t 120–1300C. Отобрать одинаковые по размеру семена разных культур (томатов, огурца, и др.) и разложить по 30 шт. в чашки Петри на фильтроваль-

69

ную бумагу и залить по 10 мл раствора NaCl c различным осмотическим потенциалом в следующей последовательности: 1 чашка Н2О – 10 мл; 2 чашка раствор NaCl – 2,0 атм.; 3 чашка – 4,0 атм.; 4 чашка – 6,0 атм.; 5 чашка –8,0 атм.; 6 чашка – 10 атм. Подписать на крышке вариант, закрыть и поставить в термостат на проращивание при температуре 22–250С. Подсчет проросших семян проводится на 7-й день, в контроле и вариантах с солями, а также замерить длину корней и надземной части. Результаты записываются в таблицу.

Формула для расчета солеустойчивости:

Р = b/а х 100,

где: Р – солеустойчивость в %; a – количество проросших в контроле; b– количество проросших на растворе соли.

Сделать выводы о степени солеустойчивости изученных культур, а также о влиянии засоления на ростовые процессы проростков.

Работа 9. Защитное действие сахаров на цитоплазму при замораживании

Оборудование и реактивы: столовая свекла; 1,0

и 0,5М р-р сахарозы;8 % р-р NaCI в капельнице, снег или лед; емкость с кристаллизатором, обложенным опилками; соль поваренная, лопаточка для перемешивания охлаждающей смеси, термометр до -25 0С; безлопастная бритва, скальпель или пробочное сверло D 0,5–1,0 см, микроскоп,предметныеи покровные стекла, карандаш по стеклу, полоски фильтровальной бумаги, 3 пробирки, кристаллизатор с водой, штативы для пробирок, дистиллированная вода, химический стакан с холодной водой.

70