4. Возникновение и развитие гистологии как самостоятельной науки. Методы исследования строения, химического состава и метаболизма клеток и тканей.

Гистология (от греч. histos - ткань, logos - учение) - наука, изучающая закономерности развития, строения и жизнедеятельности тканей в историческом и индивидуальном развитии многоклеточных животных и человека.

Успехи гистологии как науки о строении и происхождении тканей и их компонентов прежде всего связаны с развитием техники, оптики и методов микроскопирования. Микроскопические исследования позволили накопить данные о строении клеток и тканей организма и на этом основании сделать теоретические обобщения.

• 1590 год — голландские мастера Ханс и Захарий Янсены создали первый прототип микроскопа, используя комбинацию двух линз. Этот прибор давал увеличение в 3–9 раз.

• 1609 год — Галилео Галилей сконструировал «оккиолино» — прибор, который можно считать ранним микроскопом.

• Роберт Гук (1665) — английский учёный, используя усовершенствованный микроскоп, впервые описал клеточную структуру пробки (покровной ткани растений) и ввёл термин «клетка».

• В 1671 г. Н. Грю в своей книге «Анатомия растений» писал о клеточном строении как о всеобщем принципе организации растительных организмов. Н. Грю впервые ввел в употребление термин «ткань» для обозначения растительной массы, т. к. напоминала ткани одежды.

• Антони ван Левенгук (1670–1720) — голландский натуралист, самостоятельно шлифовавший линзы, создал простейшие однолинзовые микроскопы с увеличением до 270 раз. Он первым наблюдал бактерии, сперматозоиды, эритроциты и одноклеточных организмов.

Далее несовершенство микроскопов и мировоззрения не позволяли делать существенные открытия

• М. В. Ломоносов предложил ряд технических усовершенствований конструкции микроскопа и его оптической системы. Так, трудами многих отечественных (петербургских), а также голландских ученых и мастеров были созданы ахроматические микроскопы, которые сделали более достоверными микроскопические наблюдения и позволили перейти к систематическому изучению структурных элементов самых разнообразных животных и растительных организмов.

В XIX в. большое влияние на развитие учения о клетке и тканях оказали работы Пуркинье, Шлейдена, Лейдига, Мюллера, Шванна, Вирхова, Келликера, Вальдейера и др.

Хотя многие исследователи высказывали предположение о клеточном строении организмов, только. Т. Шванн ясно сформулировал основные положения так называемой клеточной теории. Важнейший вывод данной теории состоял в том, что клетки представляют собой элементарные универсальные структурные единицы всех растений и животных.

Вскоре гистолог Р. Келликер распространил положения клеточной теории на ранние стадии эмбрионального развития организма. В 1841–1844 гг. он показал, что сперматозоид и яйцо являются клетками. Из клеток состоит и организм (зародыш), возникающий в ходе дробления оплодотворенной женской половой клетки.

Параллельно с развитием клеточной теории складывались представления о том, что клетки в составе организма образуют системы более высокого порядка – ткани.

• В 1801 г. французский анатом М. Ф. К. Биша (1771–1802) на основе микроскопических исследований предложил первую классификацию тканей.

• Его ученик К. Майер ввел термин «гистология» в изданном в 1819 г. труде «О гистологии и новом подразделении тканей человеческого тела».

В середине XIX в. начался период бурного развития описательной гистологии. 

Однако научная мысль во второй половине XIX в. не могла плодотворно развиваться без дальнейших успехов гистологической техники и методов микроскопического исследования. В этот период были введены в практику и усовершенствованы водные и масляные иммерсионные объективы, изобретен микротом, применены новые фиксаторы (формалин, осмиевая кислота, хромовая кислота). Весьма плодотворным оказался метод импрегнации солями серебра, разработанный итальянским ученым К. Гольджи, описавшим внутриклеточный сетчатый аппарат (комплекс Гольджи). Этот метод и его модификации позволили провести фундаментальные исследования нервной системы (Р. Кахаль) и создать основы нейрогистологии.

Благодаря успехам в области изучения строения клетки в конце XIX в. были заложены основы цитологии, но микроскопирование фиксированных клеток не позволяло судить о процессах жизнедеятельности в них.

Методы прижизненного введения красителей, примененные многими исследователями в то время, введение инородных тел в организм и другие методы сделали возможным изучение физиологии гистологических структур.

Далее план такой: надо писать методы чего (ну как ниже написано) и перечислять то, что написано жирным, а то, что рядом – это пояснение, если спросят

Методы исследования клеток и тканей:

1) В обычных световых микроскопах источником освещения служит естественный или искусственный свет. С помощью светового микроскопа можно увидеть отдельные клетки и их внутриклеточные структуры - органеллы, включения. Для усиления контрастности микрообъектов применяют их окрашивание.

2) Ультрафиолетовая микроскопия - используют более короткие ультрафиолетовые лучи. Разрешение в 2 раза больше, чем в обычных световых микроскопах. Невидимое глазом изображение преобразуется в видимое с помощью регистрации на фотопластинке или путем применения специальных устройств.

3) Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия - основано на том, что атомы и молекулы ряда веществ, поглощая коротковолновые лучи, переходят в возбужденное состояние. Обратный переход из возбужденного состояния в нормальное происходит с испусканием света, но с большей длиной волны. Длина световой волны флюоресценции всегда больше длины волны возбуждающего света, поэтому их разделяют с помощью светофильтров и изучают изображение объекта только в свете флюоресценции.

• Первичной флюоресценцией обладают серотонин, катехоламины (адреналин, норадреналин), содержащиеся в нервных, тучных и других клетках, после фиксации тканей в парах формальдегида при 60-80 °С (метод Фалька).

• Вторичная флюоресценция возникает при обработке препаратов специальными красителями - флюорохромами.

4) Фазово-контрастная микроскопия - служит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных живых объектов, невидимых при обычных методах микроскопирования. Кольцевая диафрагма (в конденсоре) и фазовая пластинка (в объективе) дает возможность преобразовать не воспринимаемые глазом фазовые изменения прошедшего через неокрашенный препарат света в изменения его амплитуды, т. е. яркости получаемого изображения.

5) Микроскопия в темном поле - позволяет исследовать живые клетки. В микроскопе есть специальный конденсор, освещающий препарат строго косым светом. Таким образом, поле выглядит темным, а мелкие частицы в препарате отражают свет, который далее попадает в объектив.

6) Поляризационная микроскопия - является модификацией светового микроскопа, в котором установлены два поляризационных фильтра. Через первый фильтр свет проходит только в одном направлении, второй фильтр имеет главную ось, которая располагается перпендикулярно первому фильтру, и он не пропускает свет. Получается эффект темного поля. Структуры, содержащие продольно ориентированные молекулы (коллаген, микротрубочки, микрофиламенты) и кристаллические структуры обладают свойством вращать ось световых лучей, исходящих из первого фильтра. При изменении оси вращения данные структуры проявляются как светящиеся на темном фоне.

7) Электронная микроскопия. В электронном микроскопе используется поток электронов с волнами более короткими, чем в световом микроскопе. Теоретически рассчитано, что разрешаемое расстояние в этих условиях может быть в 100 000 раз меньше, чем в световом микроскопе. В гистологии используются просвечивающие электронные микроскопы – для плоскостного изображения, сканирующие электронные микроскопы – для трехмерного изображения

• Электронная микроскопия с использованием метода замораживания-скалывания применяется для изучения деталей строения мембран и межклеточных соединений.

• Метод криоэлектронной микроскопии. Быстро замороженный тонкий слой (около 100 нм) образца ткани помещают на микроскопическую решетку и исследуют в вакууме микроскопа при -160 °С.

• Метод электронной микроскопии замораживания-травления применяют для изучения внешней поверхности мембран клеток.

• Методы контрастирования солями тяжелых металлов позволяют исследовать в электронном микроскопе отдельные макромолекулы - ДНК крупных белков (например, миозин). При негативном контрастировании изучают агрегаты макромолекул (рибосомы) либо белковые филаменты (актиновые нити).

• Электронная микроскопия ультратонких срезов, полученных методом криоультрамикротомии. 

• Методы сверхвысоковольтной микроскопии – для объектов с большой толщиной

Методы исследования живых клеток и тканей:

1) Витальное и суправитальное окрашивание. При витальном (прижизненном) окрашивании клеток и тканей краситель вводят в организм животного, при этом он избирательно окрашивает определенные клетки, их органеллы или межклеточное вещество. Суправитальным окрашиванием называют окрашивание живых клеток, выделенных из организма.

2) Исследования живых клеток и тканей в культуре (in vitro) (культивирования).  Выделенные из организма человека или животного клетки, маленькие образцы тканей или органов помещают в стеклянные или пластмассовые сосуды, содержащие специальную питательную среду - плазму крови, эмбриональный экстракт, а также искусственные среды. Метод культивирования клеток позволяет изучать их жизнедеятельность, размножение, дифференцировку, взаимодействие с другими клетками и др.

3)Клеточные гибриды. При слиянии двух клеток различных типов образуется гетерокарион - клетка с двумя ядрами. Для получения гетерокариона суспензию клеток обрабатывают полиэтиленгликолем или инактивированными вирусами для повреждения плазмолемм клеток, после чего клетки способны к слиянию. Клонирование гибридных клеток приводит к образованию гибридных клеточных линий, которые используются для изучения генома.

4) Гибридомы. Клеточные линии гибридом используют для получения моноклональных антител. Определенный вид антител получают при иммунизации мышей конкретными антигенами. Если клонировать такие иммунизированные лимфоциты, то можно получить большое количество однородных антител. Однако время жизни В-лимфоцитов в культуре ограничено. Поэтому производят их слияние с «бессмертными» опухолевыми клетками (В-лимфомы). В результате образуются гибридомы (гибрид-клетка с геномом от двух разных клеток; -ома - окончание в названиях опухолей). Такие гибридомы способны размножаться длительно в культуре и синтезировать антитела определенного вида.

5) Технология рекомбинантных ДНК. Классические генетические методы позволяют изучать функцию генов, анализируя фенотипы мутантных организмов и их потомства. Технология рекомбинантных ДНК дополняет эти методы, позволяет проводить детальный химический анализ генетического материала и получать в больших количествах клеточные белки.

Методы исследования хим. состава и метаболизма:

1) Цито- и гистохимические методы. Эти методы позволяют выявлять локализацию различных химических веществ в структурах клеток, тканей и органов и основаны на специфичности реакции между химическим реактивом и субстратом, входящим в состав клеточных и тканевых структур, а также окрашивании продуктов химических реакций. Описание многочисленных цито- и гистохимических методов дается в специальных руководствах.

• Сочетание гистохимических методов с методом электронной микроскопии привело к развитию нового перспективного направления - электронной гистохимии. Этот метод позволяет изучать локализацию различных химических веществ не только на клеточном, но и на субклеточном и молекулярном уровнях.

2) Метод радиоавтографии. Этот метод дает возможность наиболее полно изучить обмен веществ в разных структурах. В основе метода лежит использование радиоактивных элементов (например, фосфора ³²Р, углерода ¹⁴С, серы ³⁵S, водорода ³Н) или меченных ими соединений. В участках препарата, где фотоэмульсия соприкасается с радиоактивным веществом, происходит фотореакция, в результате которой образуются засвеченные участки (треки).

3) Методы иммунофлюоресцентного и иммуноцитохимического анализа. Применение антител. В связи с высокой специфичностью антител в отношении антигенов они могут быть использованы для выявления любых белков клетки. Метод основан на реакциях антиген-антитело. Для усиления специфичности реакции применяют моноклональные антитела. Антитела можно использовать для изучения антигенов как на световом, так и на ультраструктурном уровне с помощью электронного микроскопа. Методы иммунофлюоресцентного и иммуногистохимического анализов широко и эффективно используются в научных исследованиях и в лабораторной диагностике.

4) Фракционирование клеточного содержимого. Фракционировать структуры и макромолекулы клеток можно различными методами - ультрацентрифугированием, хроматографией, электрофорезом.

• Ультрацентрифугирование. С помощью этого метода клетки можно разделить на органеллы и макромолекулы. Вначале оседают (седиментируются) на дне пробирки более крупные части (ядра, цитоскелет). При дальнейшем увеличении скоростей центрифугирования надосадочных фракций последовательно оседают более мелкие частицы - сначала митохондрии, лизосомы и пероксисомы, затем микросомы и мельчайшие пузырьки и, наконец, рибосомы и крупные макромолекулы. При центрифугировании различные фракции оседают с различной скоростью, образуя в пробирке отдельные полосы, которые можно выделить и исследовать.

• Хроматография широко используется для фракционирования белков.

• Электрофорез позволяет разделить белковые молекулы с различным зарядом при помещении их в ) электрическое поле.

5) Изучение химического состава живых клеток. Для изучения распределения веществ и их метаболизма в живых клетках используют методы ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) и микроэлектродную технику.

• ЯМР позволяет изучать малые молекулы низкомолекулярных веществ. Образец ткани содержит атомы, которые характеризуются способностью поглощать энергию на различных резонансных частотах.

• Микроэлектродная техника. Микроэлектроды представляют собой стеклянные трубочки, заполненные электропроводящим раствором (обычно раствор КСl в воде). Кончик такой трубочки можно вводить в цитоплазму клетки через плазмолемму и определять концентрацию ионов Н+, Na+, К+, Сl^-, Са²+, Mg²+, разность потенциалов на плазмолемме, а также производить инъекцию молекул в клетку. Микроэлектродную технику применяют для изучения транспорта ионов через специальные ионные каналы (специализированные белковые каналы) в плазмолемме - этот метод позволяет исследовать функцию одиночной белковой молекулы.