ВИЧ-инфекция

Резистентность и тропизм 343

8. Резистентность и тропизм

EVA WOLF UND PATRICK BRAUN

Вирусологической целью антиретровирусной терапии является снижение вирусной нагрузки ниже порога количественного определения, составляющего 50 копий/мл (DAIG 2012). Скачки вирусной нагрузки на фоне супрессивной АРТ могут быть временными колебаниями, не имеющими биологического или статистического значения (см. раздел 6.11. «Мониторинг АРТ»). Тем не менее, повторно определяемая вирусная нагрузка при активной вирусной репликации свидетельствует о риске развития резистентности (Delaguerre 2009). Согласно данным ретроспективного когортного исследования, риск вирусологической неудачи повышен при вирусной нагрузке от 100 до 300 копий/мл (Garcia-Gasco 2008). Максимальная доля резистентных вирусов обнаруживается при вирусной нагрузке от 1000 до нескольких десятков тысяч копий/мл (Prosperi 2011).

Быстрое появление резистентных вариантов вируса обусловлено быстрым метаболизмом ВИЧ – у пациентов, не получающих лечения, ежедневно образуются около 10 миллиардов новых вирусных частиц (Perelson 1996) – и высокой частотой ошибок при обратной транскрипции вирусного генома. Несмотря на то, что высокая частота мутаций обеспечивает образование новых вирусных вариантов («псевдовиды») даже без АРТ, клинически значимая селекция мутаций резистентности происходит только на фоне приема АРП. Если вирус однократно приобрел одну или несколько мутаций резистентности, то он, ввиду сниженной чувствительности к АРТ, будет иметь селекционное превосходство над вирусом дикого типа (Drake 1993). Резистентные вирусные варианты представляют собой существенную причину вирусологической неудачи на фоне АРТ. Сегодня, благодаря большому количеству новых препаратов, часто удается составить эффективную комбинацию, даже несмотря на длительное предшествующее лечение, для этого необходимо учитывать профиль лекарственной резистентности. В данной главе, наряду с общей информацией, описаны методы оценки резистентности и тропизма, а также клинически значимые мутации резистентности с их интерпретацией. Большинство данных было получено при наблюдении за пациентами, являющимися носителями вирусного подтипа B, который преобладает в Северной Америке, Центральной Европе и Австралии, тем не менее, во всем мире его частота составляет лишь 10% (Buonaguro 2007). В последние годы также возрастает количество исследований по изучению не-B-подтипов, отдельные из которых имеют особые пути и типы развития резистентности (Snoeck 2006, Siu 2014).

Методы оценки резистентности

Существуют анализы на генотипическую и фенотипическую резистентность (Wilson 2003). При оценке генотипической резистентности следует проводить различия между традиционным генотипированием (популяционное секвенирование) и ультрачувствительными методами секвенирования.

К зарегистрированным FDA и используемым в лабораториях тест-системам для традиционного генотипирования относятся

ВИЧ-1 TrueGene™ (Siemens Healthcare Diagnostics)

ViroSeq™ (Abbott Molecular/Applera Corp. of Applied Biosystems and Celera).

Традиционное генотипирование, как правило, выявляет только вирусные штаммы, имеющие долю в общей вирусной популяции не менее 20 %.

Для научного анализа минорных вирусных популяций иногда используются также дорогостоящие ультрачувствительные молекулярно-биологические методы (аллель-

специфическая ПЦР-реалтайм, полногеномное секвенирование) с порогом определения 0,1- 5 %. Клиническое значение минорных штаммов, выявленных данными методами, не является однозначным, в частности, оно усиленно обсуждается в рамках проблем применения ННИОТ (Li 2011). Высокочувствительные системы секвенирования, такие как

344 Антиретровирусная терапия (АРТ)

GS FLX (Roche/454 Life Sciences), HiScanSQ (Illumina) и SOLiD (Life Technologies), чаще всего применяются только в рамках научных проектов. С появлением таких аппаратов, как

GS Junior (Roche/454 Life Sciences), Ion Torrent PGM (Life Technologies) или MiSeq (Illumina),

которые могут более выгодно использоваться для обработки небольших серий образцов, эти технологии нового поколения также стали представлять интерес для рутинной диагностической практики. Тем не менее, до начала их повсеместного использования необходимо провести их оценку и интерпретацию результатов, в том числе уточнить клиническое значение минорных вариантов и возможность интеграции этих методов в рутинную клиническую практику. Следует отметить, что большинство подобных аппаратов и наборов реагентов еще не сертифицированы.

Анализ на фенотипическую резистентность в Германии проводится редко ввиду существенных временных затрат и высокой стоимости. Если общая стоимость анализа на генотипическую резистентность, в зависимости от лаборатории и используемого метода, составляет 260-400 евро, цена фенотипического исследования как минимум вдвое выше.

Коммерчески доступны следующие тест-системы для анализа на фенотипическую

резистентность:

PhenoSense™ (Monogram Biosciences)

PhenoTecT™ (InPheno)

Phenoscript™ (VIRalliance)

Для проведения анализа на резистентность требуется определенное минимальное количество вируса. В зависимости от лаборатории и используемого метода, оно составляет от 100 до 1000 копий/мл, при низкой виремии выполнение анализа на резистентность часто не представляется возможным.

Общая информация о фенотипировании

При выполнении анализа на фенотипическую резистентность проводится прямая количественная оценка чувствительности вируса к лекарственным препаратам. Измеряется способность вирусных изолятов к репликации в клеточной культуре под селекционным действием отдельных АРП (в высоких концентрациях), по сравнению с вирусом дикого типа. Концентрация препарата, необходимая для ингибирования репликации вирусного изолята в клеточной культуре на 50 %, носит название IC50 (50 %-ная ингибирующая концентрация). Чувствительность оценивается по коэффициенту соотношения измеренной IC50 для опытного вируса и IC50 для эталонного вируса дикого типа. При интерпретации этот коэффициент – также называемый фактором резистентности (ФР) или «кратностью изменения» – сравнивается с так называемым пороговым значением. В идеале он показывает, до какого значения может повышаться фактор резистентности ВИЧ-изолятов в сравнении с вирусом дикого типа без клинически значимой потери активности.

Таблица 1: Преимущества и недостатки анализа на фенотипическую резистентность

Анализ на фенотипическую резистентность

Резистентность и тропизм 345

Технические, биологические и клинические пороговые значения

Различают три типа пороговых значений.

Техническое пороговое значение – это степень допустимых колебаний показателей, измеряемых данным прибором.

Биологическое пороговое значение – это степень естественных колебаний чувствительности вирусного изолята дикого типа.

Клиническое пороговое значение показывает, повышение IC50 до какого уровня (во сколько раз) еще следует считать неограниченной активностью препарата. Данный показатель является клинически значимым. Полная резистентность к лекарственному препарату часто развивается не внезапно, а постепенно, при постепенном изменении обмена аминокислоты (особенно характерно для резистентности к усиленным ИП). В большинстве случаев указываются верхнее и нижнее клинические пороговые значения. При достижении нижнего порогового значения вирусологический ответ уже несколько снижен, при достижении верхнего порогового значения вирусологического ответа уже не следует ожидать. Для новых препаратов данные о клинических пороговых значениях часто отсутствуют, в этих случаях следует ориентироваться на биологические пороговые значения.

При анализе на фенотипическую резистентность нельзя выявить мутации, которые сами по себе не обусловливают наличие резистентности, но указывают на передачу резистентного штамма, развитие резистентности в настоящий момент или регрессию резистентности.

Общая информация о генотипировании

Наследственный материал ВИЧ, как правило, состоит из двух нитей РНК (рибонуклеиновая кислота), которые содержат генетическую информацию о вирусе. В нуклеотидной последовательности генома ВИЧ группы, состоящие из трех нуклеотидов, также называемые кодонами, кодируют определенные аминокислоты, образующие белковую последовательность. Для обозначения мутаций резистентности используется число, соответствующее номеру кодона в пределах гена, и две буквы. Буква перед числом обозначает аминокислоту, которая кодирует этот кодон в вирусе дикого типа. Буква после числа обозначает аминокислоту, кодируемую мутантным кодоном. Мутация, заключающаяся в изменении нуклеотидной последовательности в кодоне, может привести к образованию другой аминокислоты, что влияет на функцию белка и может привести к потере эффекта соответствующих антиретровирусных препаратов. К примеру, мутация M184V происходит в 184 кодоне гена ОТ и приводит к замене метионина (М) на валин (V) в ферменте ОТ. Эта мутация определяет резистентность вируса к 3TC и FTC.

Есть так называемые «скрытые мутации», которые не приводят к замене аминокислоты. Клиническое значение имеют только те мутации, которые приводят к замене аминокислоты и изменению структуры белка. К примеру, эти изменения могут способствовать формированию резистентности. Тем не менее, существуют также «летальные» мутации, которые приводят к формированию дефектной структуры белка и прерыванию цикла развития вируса.

Генотипический метод позволяет анализировать мутации, ассоциированные с резистентностью. Мутации выявляются методом прямого секвенирования амплифицированного генома ВИЧ или методом гибридизации олигонуклеотидов дикого типа и мутантных вариантов. Большое значение для принятия решения о терапии имеет секвенирование гена ВИЧ pol, который кодирует синтез таких вирусных ферментов, как протеаза, обратная транскриптаза и интеграза, а также секвенирование гена env, который кодирует синтез оболочечных белков gp41 и gp120. Результаты исследований свидетельствуют о значимости в отношении резистентности других генных локусов, таких как ген РНКазы H и gag. В данном разделе они не описаны, поскольку их анализ проводился, в основном, в рамках научных проектов и не применялся в рутинной клинической практике.

346 Антиретровирусная терапия (АРТ)

Основой для интерпретации генотипической резистентности является корреляция между генотипом, фенотипом и клиническим ответом на лечение. Соответствующие данные получены из исследований селекции in vitro, клинических исследований, клинических наблюдений и многочисленных двойных измерений, в которых изучалось влияние мутаций на формирование фенотипической резистентности.

Таблица 2: Преимущества и недостатки традиционного анализа на генотипическую резистентность (популяционное секвенирование).

Анализ на генотипическую резистентность

Правила, на которых базируется система интерпретации результатов

Система интерпретации результатов генотипирования часто базируется на правилах, выведенных экспертами на основании литературных данных, и подвергается переработке 1-2 раза в год. В Германии для интерпретации мутаций резистентности применяется первичный алгоритм, разработанный НКО HIV-Grade (Obermeier 2012). Стэндфордская база данных по лекарственной резистентности ВИЧ (HIVdb) содержит, наряду с данным алгоритмом, обширное количество данных с разъяснением и статистической оценкой мутаций, ассоциированных с резистентностью. Информация о важнейших системах интерпретации данных представлена в Таблице 3. Коммерческие производители тест-систем для выявления резистентности в ходе их разработки чаще всего использовали эти указания по интерпретации данных.

Резистентность и тропизм 347

Система интерпретации, основанная на клинических данных, и предполагаемый фенотип

В отличие от разработанных экспертными группами тест-систем, интерпретация результатов которых базируется на научных принципах, существуют механизированные системы, такие как geno2pheno (Beerenwinkel 2003) или vircoType™ ВИЧ-1 (больше не применяется с конца

2013 года), в которых интерпретация результатов основана на методе опорных векторов или регрессионной модели – целью данных методик является прогнозирование вирусологического ответа на лечение и фенотипа на основании генетической информации. При этом «предполагаемый фенотип» соотносится с индивидуальным типом генотипической резистентности без дополнительного фенотипического исследования. Основу для этого составляют базы данных, содержащие парные результаты генотипического и фенотипического исследования.

Методы оценки тропизма

Чтобы проникнуть в клетку-мишень, помимо CD4-рецепторов, ВИЧ нуждается в так называемых корецепторах. Двумя важнейшими из них являются хемокиновые рецепторы CCR5 и CXCR4. В зависимости от типа требуемого корецептора («тропизм») вирусы делятся на CCR5-тропные (R5-тропные) и CXCR4-тропные (X4-тропные). Вирусные штаммы, нуждающиеся в обоих корецепторах, носят название «вирусы с двойным тропизмом». Поскольку анализ на тропизм не позволяет отличить эти вирусы от смеси R5-тропных и X4-тропных вирусов, эта группа вирусных штаммов рассматривается как «смешанная»

(D/M-тропная).

Как и анализ на резистентность, анализ на тропизм может проводиться генотипическим или фенотипическим методом (Braun 2007). В европейских руководствах указаны обе возможности (Vandekerckhove 2011). Преимущества и недостатки обоих методов представлены в Таблице 4.

Фенотипический метод анализа на тропизм

Трофайл® компании Monogram является наиболее известным методом фенотипического анализа на тропизм ввиду его применения в регистрационных исследованиях по маравироку. Тест-система Трофайл® ES (Трофайл® с усиленной чувствительностью) позволяет выявлять минорные вирусные популяции с чувствительностью 1 %. Иногда данный тест также позволяет обнаруживать провирусную ДНК при низкой вирусной нагрузке <1000 копий РНК ВИЧ/мл. Другим коммерчески доступным фенотипическим методом анализа является Феноскрипт® ENV (EuroFins/VIRalliance). Соответствие между обоими методами анализа в клинических исследованиях составляло около 85 % (Skrabal 2007). В настоящее время продолжается разработка новых тест-систем для фенотипического анализа (они еще не представлены на рынке) (Mulinge 2013).

Генотипический метод анализа на тропизм

При генотипическом анализе на тропизм, в отличие от фенотипического, интерес представляет только секвенирование V3-локуса гена gp120. Данный участок гена определяет вирусный тропизм, даже при наличии нуклеотидных замен в других локусах гена gp120, таких как V1/V2 и C4, или гена gp41. Предпочтительным методом при вирусной нагрузке от 50 до 200 копий РНК ВИЧ/мл является популяционное секвенирование V3-петли провирусной ДНК. На основании проанализированной нуклеотидной последовательности можно прогнозировать тропизм вируса, для этого используются биоинформационные методы, такие как иерархическое правило, метод опорных векторов (SVM) или «дерево решений» (Garrido 2008). Информация о наиболее часто применяемых методах анализа на тропизм, таких как geno2pheno[корецептор] и WebPSSM, находится в свободном доступе на следующих сайтах:

348 Антиретровирусная терапия (АРТ)

geno2pheno[корецептор]: http://coreceptor.bioinf.mpi-sb.mpg.de/cgi-bin/coreceptor.pl

WebPSSM: http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/webpssm/

Интерпретация на основании результатов корецепторного анализа geno2pheno широко распространена, полученные результаты имеют достаточную степень соответствия результатам анализа, проведенного с использованием тест-системы Трофайл® ES, и имеют основное диагностическое значение в Европе (Prosperi 2010, Sierra 2011, Kagan 2014). В отличие от фенотипической оценки, генотипический анализ не позволяет провести различия между X4-тропными штаммами и штаммами, имеющими двойной/смешанный тропизм, поэтому результат анализа geno2pheno может характеризоваться определенной частотой ложноположительного результата (ЛПР) в отношении прогностической вероятности выявления X4-тропных штаммов. ЛПР, равная 0,1 %, с большой долей вероятности означает наличие X4-тропизма, в то время как ЛПР, равная 90 %, в большей степени свидетельствует об R5-тропизме, поскольку вероятность ложного выявления X4 составляет 90 %.

В настоящее время составители немецких клинических рекомендаций придерживаются пороговых значений, указанных ниже: при ЛПР менее 5 % данный вирусный штамм следует отнести к X4-тропным, при ЛПР более 15 % – к R5-тропным (Walter 2012). Эти пороговые значения относятся также к анализу на содержание провирусной ДНК. При значении ЛПР от 5 % до 15 % возможность назначения маравирока может рассматриваться в зависимости от активности одновременно принимаемых препаратов. В европейских руководствах в качестве порога для различения R5- и X4-тропных вирусов рекомендуется использовать значение ЛПР, равное 10 %, причем анализ должен проводиться трехкратно, что требует больших материальных затрат (Symons 2012). При ЛПР более 20 % процедура анализа может быть упрощена (Vandekerckhove 2011). Последнее значение также указано в европейских руководствах в качестве порогового уровня для анализа на содержание провирусной ДНК.

Ультрачувствительное секвенирование

Чтобы изучить клиническое значение минорных X4-тропных вирусов, в исследованиях по генотипированию также применяются ультрачувствительные методы, такие как ультраглубокое секвенирование (УГС). В отличие от популяционного секвенирования (ПС), которое позволяет выявить X4-тропные вирусы в том случае, если их доля составляет не менее 20 %, метод УГС позволяет выявить их даже в количестве менее 1 %. В одном из исследований по применению комбинации маравирок+атазанавир/r у АРТ-наивных пациентов для анализа на тропизм применялась тест-система Трофайл® ES. Пробы подвергались повторному ретроспективному анализу с использованием методов ПС (интерпретация geno2pheno, частота ЛПР 5,75 %) и УГС (частота ЛПР 3,5%; пороговое значение для отсутствия R5-тропизма – 2%) (Portsmouth 2013). На основании 199 парных результатов было установлено, что доля соответствия результатам, полученным с помощью тест-системы Трофайл® ES, составила 91,7 % для метода ПС и 89,6 % для метода УГС. Пробы, которые тест-системой Трофайл® ES были классифицированы как не-R5-тропные, а методом ПС – как R5-тропные, составляли в среднем лишь 2,1 % всех не-R5-тропных вирусов (медиана 0,1%).

Сравнение генотипических и фенотипических методов анализа на тропизм

Преимущество генотипического метода, как и в случае выполнения анализа на резистентность, заключается в широкой доступности и быстром получении результата. В ходе анализа было установлено, что результат популяционного секвенирования, как и результат фенотипического анализа на тропизм, коррелировал с вирусологическим ответом на лечение, в связи с чем оба метода выявления вирусов подтипа В были признаны равнозначными (Braun 2009, Poveda 2012, McGovern 2012). В отношении вирусных штаммов, не относящихся к подтипу В, было описана выраженная дискордантность результатов, особенно характерная для CRF01_AE, CRF02_AG, A и F. Результаты, полученные с

Резистентность и тропизм 349

использованием методов Geno2Pheno и WebPSSM, по-видимому, характеризуются завышенными значениями показателей потребности в CXCR4 (Delgado 2011, Mulinge 2013). Дополнительное преимущество генотипирования заключается в том, что выполнение анализа возможно даже при низкой или неопределяемой вирусной нагрузке ввиду наличия провирусной ДНК. Это может иметь значение при рассмотрении вопроса о переключении терапии вследствие побочных эффектов. При этом X4-тропные вирусы имеют тенденцию находиться в плазме крови скорее в виде клеточно-ассоциированной провирусной ДНК, чем в виде РНК (Verhofstede 2009). Существует достаточно выраженная корреляция между результатом анализа, выполненного с помощью тест-системы Трофайл®, и генотипически предполагаемым тропизмом, установленным на основании результата анализа провирусной ДНК (Poveda 2012). Представленная на рынке тест-система Трофайл® ES, позволяющая выполнять анализ как РНК, так и провирусной ДНК, в Германии применяется в качестве подтверждающего метода при любых сомнительных результатах.

Таблица 4: Преимущества и недостатки генотипического (GTT) и фенотипического (PTT) методов анализа на тропизм (сравнительная характеристика), в качестве примеров использованы методы использования тест-систем geno2pheno и Трофайл® ES.

Механизмы развития резистентности

НИОТ принимаются в форме пролекарств и приобретают активность только в трифосфатной форме. Для нуклеотидных аналогов обязательны два этапа фосфорилирования, для нуклеозидных аналогов – три этапа. Фосфорилированные формы НИОТ вступают в конкуренцию с естественными дНТФ (дезоксинуклеотидтрифосфат), которые участвуют в образовании провирусной ДНК. Так ингибируется дальнейший синтез цепи, осуществляемый под действием обратной транскриптазы (ОТ), что приводит к блокированию процесса элонгации провирусной ДНК и разрыву цепи. Различают два биохимических механизма развития вирусной резистентности (De Mendoza 2002):

Стерическое ингибирование обусловлено мутациями, которые делают возможным распознавание ферментом ОТ структурных различий между НИОТ и дНТФ. При этом вместо НИОТ в структуру ДНК включаются дНТФ, к таким мутациям относятся, к примеру,

M184V, Q151M, L74V und K65R (Naeger 2001, Clavel 2004).

При АТФ- (аденозинтрифосфат) или пирофосфат-опосредованном фосфорилировании уже встроившиеся в ДНК НИОТ снова высвобождаются из цепи. Это происходит в случае наличия мутаций резистентности к тимидиновым аналогам, таких как M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y и K219Q (Meyer 2000). Они вызывают перекрестную резистентность к

350 Антиретровирусная терапия (АРТ)

различным препаратам класса НИОТ, которая, тем не менее, характеризуется различной степенью выраженности. Мутация K65R противодействует эксцизии из цепи ДНК уже встроившихся НИОТ. При наличии мутации K65R одновременно существует два механизма: с одной стороны, снижается интенсивность включения НИОТ в ДНК, с другой стороны, ингибируется эксцизия НИОТ из ДНК – это вызывает снижение чувствительности к большинству НИОТ, кроме AZT, чувствительность к которому, напротив, повышается (White 2005), что лежит в основе феномена восстановления чувствительности.

ННИОТ также ингибируют ОТ, однако по химическому строению они отличаются от НИОТ. Будучи небольшими молекулами, они присоединяются к гидрофобному участку вблизи каталитического центра ОТ. Мутации участка связывания ОТ с ННИОТ уменьшают аффинность ингибиторов и приводят к потере эффективности. В то время как для развития полной резистентности к ННИОТ первого поколения часто достаточно одной мутации, путь формирования мутаций к ННИОТ второго поколения является более сложным (Vingerhoets 2010, Molina 2008).

ИП предотвращают расщепление вирусных белков-предшественников gag-pol под действием фермента ВИЧ-протеазы. Вследствие этого образуются вирусные частицы, не обладающие инфекционными свойствами. Резистентность к ИП, как правило, развивается медленно, поскольку для этого необходимо накопление нескольких мутаций. Различают основные и сопутствующие мутации, тем не менее, оценка профиля резистентности позволяет лишь приблизительно классифицировать имеющиеся мутации.

Основные мутации вызывают фенотипическую резистентность. К ним относятся как мутации, впервые возникшие в ходе селекции под действием лекарственного препарата, так

имутации (часто их также называют первичными мутациями), которые происходят в активном центре ВИЧ-протеазы и снижают способность ИП к связыванию с данным ферментом. Иногда эти мутации приводят к потере активности протеазы.

Сопутствующие мутации («минорные мутации», их также называют вторичными мутациями) локализуются вне активного центра и, как правило, возникают после основных мутаций. Иногда они могут компенсировать потерю вирусной приспособляемости под действием основных мутаций (Nijhuis 1999, Johnson 2013). Мутации в положениях 20, 36, 63

и77 являются полиморфными и часто происходят без селекции, что частично соответствует аминокислотам вирусов не-В-подтипа. Их вклад в развитие резистентности является незначительным и зависит от наличия других мутаций.

Таблица 5: Мутации резистентности к ИП (основные и сопутствующие)

Основные мутации

D30N, V32I, M46IL, I47VA, G48VMALSTO, I50VL, I54VAMLTS, L76V, V82ACFLMST, I84VAC, N88S, L90M

Сопутствующие мутации (по выбору)

L10F, V11I, L23I, L24I, L33FI, K43T, M46V, F53L, O58E,,G73CATS, T74P, N83D, N88DGT, L89V

(последнее обновление в июне 2012, База данных о лекарственной резистентности ВИЧ, Программа секвенирования, версия 6.2.0; http://hivdb.stanford.edu/pages/documentPage/PI mutationClassification.html)

Ингибиторы проникновения препятствуют проникновению вируса в клетку-мишень. Для этого ВИЧ своим поверхностным белком gp120 связывается с рецептором CD4, что приводит к конформационным изменениям gp120 и связыванию V3-петли gp120 с хемокиновым рецептором клетки-мишени посредством корецепторов CCR5 и CXCR4. При взаимодействии обоих гепта-повторяющихся локусов HR1 и HR2 с трансмембранным вирусным белком gp41 происходит изменение конформации gp41, которое, наконец, делает возможным встраивание gp41 в клеточную мембрану. Антагонисты CCR5 связываются с CCR5-корецепторами, предотвращая взаимодействие с gp120 и, соответственно, вход в клетку.

Ингибиторы слияния предотвращают слияние вируса с клеточной мембраной. T-20 – это синтетический пептид, который соответствует C-терминальному HR2-домену gp41 и

Резистентность и тропизм 351

обеспечивает конкурентное взаимодействие HR2 с HR1. Это предотвращает необходимые конформационные изменения gp41 и слияние с клеткой. Замена даже одной аминокислоты в HR1 может значительно снижать активность T-20.

Ингибиторы интегразы (ИИ) предотвращают интеграцию вирусного наследственного материала (провирусная ДНК) после транскрипции в наследственный материал клеткихозяина. Сначала вирусная интеграза в цитоплазме связывается с 3'-концом провирусной ДНК и образует преинтеграционный комплекс. Затем интеграза вырезает динуклеотид с обоих концов вирусной ДНК, вследствие чего образуются новые 3'-гидроксильные группы (3'-процессинг). После переноса вирусной цепи ДНК в ядро клетки интеграза связывает ее концевой участок с ДНК клетки-хозяина. Ингибиторы интегразы предотвращают перенос нити вирусной ДНК в ядро клетки (поэтому их еще называют «ингибиторы переноса цепи интегразой», INSTI). Они связываются с интегразой и проникают вместе с преинтеграционным комплексом в ядро клетки. В данном случае молекула интегразы больше не может катализировать интеграцию провирусной ДНК в клеточную ДНК. Резистентность формируется путем селекции определенных (ключевых) мутаций в гене интегразы. Тем не менее, при этом может нарушаться как перенос цепи, так и 3'-процессинг. Уже описаны различные варианты профилей резистентности. Накопление дополнительных мутаций приводит к дальнейшему снижению чувствительности (Jegede 2008).

Передача резистентных штаммов ВИЧ

Распространенность мутаций резистентности, уже имеющихся на момент начала лечения, характеризуется значительными региональными различиями. Старые научные данные по частоте и распространенности мутаций следует интерпретировать с осторожностью, поскольку не все случаи полиморфизма ассоциированы с резистентностью. В 2007 году международная исследовательская группа определила список мутаций первичной резистентности. После его унификации в 2009 году был, наконец, составлен современный перечень мутаций, который позволяет проводить сравнение международных данных по первичной резистентности (Bennett 2009).

В ходе обзора результатов 215 исследований, проведенных к 2009 году, в которых приняли участие в общей сложности 43170 пациентов со всего мира, заразившихся резистентными штаммами вируса, были получены следующие данные о распространенности: Северная Америка (12,9 %), Европа (10,9 %), Латинская Америка (6,3 %), Африка (4,7 %) и Азия (4,2 %), значительный подъем наблюдался в Азии и Африке. Причем в Северной Америке, Европе и Латинской Америке наблюдалось изменение классового характера резистентности: частота резистентности к НИОТ с течением времени значительно снижалась, частота резистентности к ННИОТ, напротив, повышалась (Frentz 2012).

Таблица 6: Распространенность первичной резистентности (%) у пациентов, не получавших лечения (выборка).

352 Антиретровирусная терапия (АРТ)

Таблица 6: Распространенность первичной резистентности (%) у пациентов, не получавших лечения (выборка) (продолжение)

В немецком исследовании на пациентах с сероконверсией, проведенном в Институте Роберта Коха, доля первично резистентных вирусов с 1996 по 2012 год оставалась относительно стабильной и составила в общей сложности 12,1 % (95 % ДИ 10,7-13,6) (Рис.1). Снижения с течением времени не наблюдалось (p=0,118). Чаще всего регистрировалась резистентность к НИОТ (6,1 %), тем не менее, с тенденцией к снижению. Резистентность к ННИОТ регистрировалась в 2,4 % случаев, причем наблюдаемое до 2007 года повышение частоты в дальнейшем не отмечалось. Вирусы, имеющие мутации резистентности к ИП, обнаруживались в 2,1 % случаев, двух- и трехклассовая резистентность встречалась редко: 1,2 % и 0,3 % случаев соответственно. Наиболее частыми мутациями резистентности к НИОТ были мутации типа TAM, также часто встречалась мутация резистентности к ННИОТ типа K103N/S и мутации резистентности к ИП типа M46L и L90M (Kuecherer 2013). У пациентов с хронической инфекцией, включенных в когорту RESINA, доля первичной резистентности с 2001 по 2012 год составляла около 10,4 %. Распространенность резистентности к НИОТ, ИП и ННИОТ составляла 6,5 %, 3,3% и 2,9 %. В последние годы возросла частота резистентности к ННИОТ (Jensen 2013). Данные о распространенности вирусной резистентности по всей Европе были получены в ходе программы SPREAD (Стратегия контроля распространенности лекарственной резистентности ВИЧ), проводимой с 2008 по 2010 год. У 9,2 % пациентов с впервые диагностированной ВИЧ-инфекцией была выявлена как минимум одна мутация резистентности. Доля резистентности к НИОТ, ННИОТ и ИП составила 5,1 %, 3,7 % и 2,3 % соответственно. Менее чем в 1 % случаев наблюдалась резистентность к двум классам препаратов (Hofstra 2013). В США с 2008 по 2014 год мутации резистентности были выявлены у 16,7 % всех пациентов с впервые установленным диагнозом ВИЧ-инфекции (Saduvala 2014).

Ультрачувствительные методы, такие как аллель-специфическая ПЦР-реалтайм (АС-ПЦР) или ультраглубокое секвенирование, чаще всего позволяют выявить большее количество мутаций резистентности, чем традиционные методы секвенирования. В одном из исследований, проведенных в Атланте, у 34 из 205 пациентов (17 %), имеющих по результатам традиционного секвенирования вирус дикого типа, были выявлены минорные мутации резистентности (Johnson 2008). В одном из английских исследований в ходе стандартного анализа 165 анонимных проб, полученных в 2003-2006 гг., частота встречаемости мутаций резистентности K103N, Y181C и M184V составила 13 %, при использовании более чувствительного метода – 19 %. В частности, при использовании более чувствительного метода доля изолятов M184V увеличилась с 0,6 % до 8 % (Buckton 2011).