6 курс / Эндокринология / Эндокринология_и_метаболизм_Фелиг_Ф_,_Бакстер_Дж_Д_,_Бродус_А_Е

ГЛЮКОЗОАЛАНИНОВЫЙ ЦИКЛ

Преобладание аланина среди всех доступных и поглощаемых печенью аминокислот, а также быстрота, с которой печень превращает его в глюкозу, указывают на значение этой аминокислоты в качестве ключевого предшественника глюкозы, имеющего белковое происхождение. Преобладание аланина среди аминокислот, высвобождаемых мышцей, нельзя объяснить, исходя из его количества как составной части клеточных белков, поскольку на долю аланина приходится не больше 7—10% аминокислотных остатков мышечных белков. Это несоответствие заставило предположить, что в мышечной ткани аланин синтезируется de novo за счет аминирования пирувата, и сформулировать представление о глюкозоаланиновом цикле [20]. Согласно этому представлению, аланин синтезируется в мышце путем трансаминирования образующегося из глюкозы пирувата и переносится в печень, в которой его углеродный скелет вновь превращается в глюкозу (см. рис. 10—5). В качестве источника аминогрупп для синтеза аланина в мышце предполагаются аминокислоты с разветвленной цепью (валин, лейцин, изолейцин), поскольку внепеченочные ткани, особенно мышцы, служат местом их окисления.

Исследования с 14С-глюкозой позволили определить, что углеродный скелет аланина, высвобождаемого мышцей, на 60% состоит из экзогенной глюкозы, тогда как углеродные атомы катаболизируемых в мышце других аминокислот не участвуют в построении этого скелета. Количественные оценки показали, что скорость кругооборота углеродных скелетов в глюкозоаланиновом цикле (в качестве конечного продукта утилизации глюкозы на периферии и предшественника глюкозы, продуцируемой печенью) составляет примерно 50% от скорости цикла Кори (лактат—глюкоза) [10, 19].

Хотя глюкозоаланиновый цикл не дает новых углеродных атомов для синтеза глюкозы de novo, он играет важную роль в гомеостазе глюкозы, как и в метаболизме азота и энергии. Дефицит аланина имеет значение в патогенезе ускоренного голодания, наблюдаемого при беременности [21], гипогликемии с кетозом у новорожденных [22] и гипогликемии при синдроме мочи кленового сиропа [23]. Аланин служит также одним из средств детоксикации аммиака при переносе в печень аминогрупп, образующихся в мышцах в процессе катаболизма аминокислот с разветвленной цепью. Гипераланинемия наблюдается при различных нарушениях ферментов мочевинного цикла, когда она может смягчать выраженность гипераммониемии [10].

Глюкозоаланиновый цикл может также иметь отношение к продукции АТФ. Превращение глюкозы в аланин обеспечивает образование 8 молекул АТФ, тогда как при ее превращении в лактат образуются лишь две молекулы АТФ. Кроме того, поскольку образование аланина облегчает окисление аминокислот с разветвленной цепью, он обеспечивает образование дополнительных 30—40 молей АТФ на 1 моль окисленной аминокислоты.

ВОССТАНОВЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА БЕЛКА И БЕЛКОВОЕ ПИТАНИЕ

Поскольку в состоянии натощак азотистый баланс в мышечной ткани отрицателен, восстановление количества мышечного белка определяется преобладанием поглощения аминокислот при приеме белка с пищей. Потребление белковой пищи (например, нежирное мясо) приводит к значительному выходу аминокислот (преимущественно аминокислот с разветвленной цепью) из органов брюшной полости [24]. Валин, изолейцин и лейцин вместе составляют более 60% от общего количества аминокислот, поступающих в системную циркуляцию, несмотря на то что на их долю приходится лишь 20% всех аминокислот, содержащихся в белковых продуктах питания. Одновременно с высвобождением аминокислот ИЗ органов брюшной полости обмен большинства аминокислот в периферической мышце изменяется таким образом, что преобладание их выхода, наблюдаемое в исходном состоянии, сменяется на преобладание их поглощения. Как это характерно и для обмена в органах брюшной полости, поглощение аминокислот тканью периферических мышц наиболее выражено применительно к аминокислотам с разветвленной цепью [24]. Поскольку они составляют лишь 20% аминокислотных ос-

татков в мышечном белке, постольку очевидно, что для синтеза белка используются не только эти аминокислоты, но и те, которые образовались в процессе катаболизма в самой мышце.

Описанные эффекты белкового питания на межорганный обмен аминокислотами и ключевая роль аминокислот с разветвленной цепью представлены на рис. 10—9, б. При этом наблюдается азотистый «цикл», когда в состоянии сытости аминокислоты с разветвленной цепью обеспечивают восстановление содержания азота в мышечной ткани. Получаемый таким образом азот как в голодном, так и в сытом состоянии высвобождается в виде аланина и глутамина. Повышение уровня аминокислот с разветвленной цепью в крови и внутри клеток, вызываемое белковым питанием, может иметь значение не только в качестве способа доставки азота.. Аминокислоты с разветвленной цепью, особенно лейцин, могут играть регуляторную роль, стимулируя синтез белка [25]. Кроме того, общее поглощение таких аминокислот мышцей регулируется инсулином и при диабете нарушается [24].

ИНСУЛИН

ИСТОРИЧЕСКИЙ ОЧЕРК

В 1899 г. фон Меринг и Минковский показали, что удаление поджелудочной же-

о том, что этот эффект является следствием выпадения действия необходимого гормона, было подтверждено в 1921 г., когда

Бантинг и Бест приготовили экстракт поджелудочной железы, способный снижать уровень сахара в крови. Это вещество, названное инсулином, .было получено в кристаллическом виде Абелем в 1926 г. Sanger определил аминокислотный состав инсулина — первого белка, последовательность которого была полностью расшифрована. В 1965 г. Katsoyannis сумел осуществить химический синтез инсулина. В 1969 г. с помощью методик рентгенодифракции была определена трехмерная структура инсулина. Steiner в 1967 г. обнаружил проинсулин — биологический предшественник инсулина более крупного размера. Позднее с помощью методик рекомбинаций ДНК удалось добиться синтеза инсулина бактериями.

ХИМИЯ

Молекула инсулина состоит из двух полипептидных цепей, обозначаемых как А- и В-цепи, соединенные двумя дисульфидными мостиками. Кроме того, имеется дисульфидный мостик между 6-м и 11-м аминокислотным остатком А-цепи (рис. 10—10). Полная молекула содержит 51 аминокислоту и обладает относительной молекулярной массой 5800 и изоэлектрической точкой 5,35; 1 мг чистого вещества содержит 24 ME. Аминокислотный состав инсулина у разных видов постоянен, за исключением остатков в положениях 4, 8, 9 и 10 А-цепи и 1, 2, 3, 27, 29 и 30 В-цепи. Чаще всего применяемыми в клинических целях инсулинами являются гормоны, экстрагируемые из поджелудочных желез свиней и крупного рогатого скота. Свиной инсулин отличается от гормона человека только присутствием аланина вместо треонина в терминальном положении В-цепи, тогда как между бычьим и человеческим инсулином существуют еще два различия [в 8-м (аланин) и 10-м (валин) положениях А-цепи] (см. рис. 10—10). Согласно результатам рентгенокристаллографических исследова-

Рис. 10—10, Аминокислотная последовательность инсулина человека. Свиной инсулин в качестве терминальной аминокислоты В-цепи содержит не треонин, а аланин. Бычий инсулин отличается от инсулина человека тем, что содержит аланин в положении 30 В-цепи, а также аланин (вместо треонина) в положении 8 и валин (вместо изолейцина) в положении 10 А-цепи.

яий, единичная ячейка кристаллического свиного инсулина состоит из инсулинового гексамера, построенного из трех димеров, расположенных вокруг оси, на которой лежат два атома цинка. Содержание цинка в большинстве кристаллических препаратов инсулина составляет примерно 0,4—0,5%. В слабых растворах инсулин адсорбируется на стекле или пластмассе (например, на стенках системы для внутривенных инфузий). Эту адсорбцию удается свести к минимуму путем добавления альбумина.

Расщепление инсулина на составляющие его А- и В-цепи путем окисления или восстановления дисульфидных мостиков приводит к полной потере им биологической активности. С другой стороны, удаление амидной группы аспарагина на карбоксильном конце А-цепи или терминального аланина В-цепи практически не влияет на активность молекулы инсулина. При удалении всего аспарагина (или аспартата) из карбоксильного конца А-цепи и аланина из соответствующего участка В-цепи теряется примерно 95% активности гормона. Удаление последовательности из 8 аминокислот (с 23-го по 30-й остаток) с карбоксильного конца В-цепи (инсулин-дезоктапептид) с помощью трипсинового гидролиза приводит к исчезновению всей определимой активности. Считается, что участок между 22-м и 26-м остатком В-цепи имеет решающее значение для связывания инсулина с его рецептором, как и для действия инсулина вообще [27].

БИОСИНТЕЗ

Инсулин синтезируется -клетками островков Лангерганса в виде одноцепочечного предшественника — проинсулина с молекулярной массой около 9000 [28]. Современные исследования на бесклеточных системахпоказывают, что ближайшим продуктом трансляции проинсулиновой мРНК является более крупный пептид с молекулярной массой 11 500, содержащий 23 дополнительных аминокислотных остатка на аминоконце молекулы. Этот предшественник получил название препроинсулина, и считают, что он быстро (в течение нескольких минут после синтеза) расщепляется микросомными протеазами до проинсулина. Дополнительный пептид в препроинсулине по своему размеру, содержанию отдельных аминокислот и положению на аминоконце сходен с дополнительными последовательностями, найденными в продуктах трансляции in vitro мРНК различных гормонов, таких, как пропаратиреоидный гормон и гормон роста, равно, как и негормональных белков, таких, как легкие цепи иммуноглобулинов [29].

Проинсулин представляет собой спиральную молекулу, в которой А- и В-цепи составляют единую последовательность за счет соединяющего пептида (С-пептида), состоящего из 26—31 аминокислотного остатка (рис. 10—11). Если аминокислотные последовательности А- и В-цепей у разных видов имеют небольшие различия, то строение соответствующих С-пептидов разнится го-

Рис. 10—11. Схематическое изображение биосинтеза проинсулина, его превращения в инсулин и С-пептид. Ген проинсулина представлен в верхней части рисунка. Эти гены содержат интроны, продукты которых исключаются из состава зрелой мРНК. Транскрипция препроинсулиновой мРНК требует присутствия фермента РНКполимеразы. Эта мРНК служит матрицей для образования цепей препроинсулина на полирибосомах. Препроинсулин расщепляется до проинсулина (средняя часть рисунка), который затем переносится в аппарат Гольджи (пластинчатый комплекс), где и происходит его превращение в инсулин (по Steiner D. F., Diabetes, 1977, 26, 322). раздо больше. Так, инсулин свиньи отличается от инсулина человека только одной аминокислотой, тогда как С-пептид человека — цепь из 23 аминокислотных остатков с молекулярной массой 3021 — отличается от свиного С-пептида 10 остатками и содержит на 2 аминокислоты меньше [30]. Столь высокая «мутабельность» согласуется с отсутствием у С-пептида специфической гормональной функции. Хотя проинсулин обнаруживает небольшую перекрестную реакцию с антителами к инсулину, он обладает всего" 3—5% от биологической эффективности нативного инсулина, Не ясно, принадлежит ли эта небольшая биологическая, активность непосредственно проинсулину, или она обусловлена его превращением тканями-мишенями в инсулин.

Синтез препроинсулина в клетке и его быстрое? расщепление-до проинсулина происходит на полисомах шероховатого эндоплазматического ретикулума. Затем в ходе энергозависимого процесса проинсулин переносится в пластинчатый комплекс (аппарат Гольджи), где происходит его упаковка в микропузырьки с гладкой поверхностью, в форме которых и осуществляется хранение и секреция (см. рис. 10—11). С

для внесения чужеродной и бактериальной ДНК в бактериальную клетку, служат либо бактериофаги, либо плазмиды. Бактерия, содержащая плазмиду, транскрибирует свой собственный ген, равно, как и внедренную последовательность, продуцируя тем самым нужный полипептид (рис, 10—12). Тот факт, что последовательность эукариотической ДНК удается клонировать и экспрессировать в прокариотических (бактериальных) клетках, может найти наиболее быстрое применение в области использования бактериального синтеза для продукции инсулина человека, нужного для лечения больных с инсулинозависимым диабетом. Такая технология тем самым может обеспечить создание альтернативного источника инсулина и в конце концов вытеснить современные способы получения гормона, заключающиеся в экстракции свиных и бычьих поджелудочных желез.

СЕКРЕЦИЯ

Исходные концентрации

Концентрация инсулина в плазме периферической венозной или артериальной крови здоровых лиц после ночного голодания составляет обычно 10—20 мкЕД/мл (0,4— 0,8 нг/мл). Как уже отмечалось, в процессе секреции инсулина освобождаются эквимолярные количества С-пептида, концентрация которого натощак составляет 0,9—3,5 нг/мл. Относительно большие количества С-пептида по сравнению с инсулином объясняются более медленным метаболическим клиренсом этого вещества [30]. Поскольку секрет островков поджелудочной железы поступает в воротную веду и поскольку печень элиминирует 50—60% поступающего в нее инсулина, концентрация его натощак в крови воротной вены в 3 раза выше, чем в периферической крови. При резких «всплесках» секреции (например, в ответ на введение глюкозы или аминокислот) градиент уровней инсулина воротная вена — периферическая кровь может повышаться до 10:1. Этот градиент концентраций инсулина может отчасти объяснять тот факт, что небольшой прирост секреции инсулина изменяет метаболизм глюкозы в печени без изменения периферической утилизации глюкозы [33].

Хотя в плазме периферической крови и можно обнаружить проинсулин, обычно на его долю приходится менее 15% от общей иммунореактивности инсулина в циркуляции. Недавно описан бессимптомный генетический дефект — семейная гиперпроинсулинемия с аутосомно-доминантной наследуемостью, при которой на долю проинсулина приходится 65—90% от общей иммунореактивности инсулина в плазме [34]. Отражает этот дефект нарушение превращения проинсулина в инсулин или нарушение биосинтеза проинсулина — неизвестно. Повышение уровня проинсулина в плазме наблюдается и у больных с инсулиномами (см. следующую главу), а также в сочетании с гипокалиемией. У больных диабетом повышение уровня проинсулина встречается довольно редко и не может объяснить нарушения толерантности к глюкозе, наблюдаемое при различных гиперинсулинемических состояниях (например, при ожирении, беременности, гиперкортицизме).

У получающих инсулин больных диабетом присутствие антител препятствует определению инсулина в крови обычными радиоиммунологическими методами. В таких условиях можно оценивать остаточный резерв секреции инсулина с помощью определения С-пептида. Кроме того, у больных с гипогликемией и гиперинсулинемией определение С-пептида может дать ответ на вопрос, имеет ли циркулирующий инсулин эндогенное происхождение (повышение уровня С-пептида) или симптомы связаны с тайным введением инсулина (снижение уровня С-пептида).

Скорость секреции инсулина, необходимая для поддержания нормальной исходной концентрации гормона, колеблется от 0,25 до 1,5 ЕД/ч. Роль исходной секреции (которая в норме происходит в интервалах между приемами пищи) подчеркивается результатами недавно проведенных исследований, свидетельствующими о том, что программированные системы инфузии инсулина,. которые обеспечивают как исходный уровень гормона, так и его повышение перед едой, гораздо более эффективны в отношении; нормализации гликемии при ювенильном диабете, чем только введение повышенных доз инсулина перед едой [35].

Углеводы

Среди различных факторов, способных стимулировать секрецию инсулина, наиболее важным с физиологической точки зрения является глюкоза. Это находит свое отражение в том, что ежемоментные колебания уровня инсулина в плазме повторяют колебания содержания глюкозы в ней (рис. 10—13). Однако точный механизм, с помо-

щью которого глюкоза действует на -клетки, вызывая высвобождение инсулина, не совсем ясен. Предложены. две альтернативные теории, одна из которых исходит из роли метаболизма глюкозы в островковых клетках, а другая—из взаимодействия молекулы глюкозы с мембранным рецептором — «глюкорецептором». В пользу метаболической теории свидетельствуют следующие наблюдения: 1) метаболизируемые сахара (гексозы или триозы) являются более мощными стимуляторами секреции инсулина, чем неметаболизируемые углеводы (например, манноза); 2) глюкоза увеличивает концентрацию интермедиатов гликолиза в островковых клетках; 3) вещества, угнетающие метаболизм глюкозы (манногептулоза и 2-дезоксиглюкоза), препятствуют секреции инсулина.

С другой стороны, имеются наблюдения, результаты которых свидетельствуют в пользу существования механизма распознавания глюкозы за счет активации ею мембранного рецептора (глюкорецептор), вследствие чего «запускается» процесс высвобождения инсулина. Эту гипотезу подтверждают данные о том, что с помощью блокаторов ферментов (йодацетат) высвобождение инсулина можно отделить от метаболиче-

ского потока глюкозы по гликолитическому пути и что -аномер глюкозы служит более эффективным стимулом секреции инсулина, чем -аномер, хотя

Рис. 10—13. Колебания уровня глюкозы, глюкагона и инсулина в плазме в течение суток у здоровых лиц, потребляющих смешанную пищу. Максимальные размахи уровня глюкозы в плазме за 24 ч обычно не достигают 300 мг/л. Малая степень колебания уровня глюкозы в плазме является следствием обратной связи с секрецией инсулина и повышения секреции инсулина под действием гормонов желудочно-кишечного тракта, выделяющихся в ответ на прием пищи. В отличие от уровня инсулина уровень глюкагона при потреблении смешанной пищи совершенно не меняется (по Tasaka Y. et al., Ногш. Metab. Res., 1975, 7, 205, с модификациями). Стрелка-

ми показано время приема пищи. оба аномера подвергаются, по-видимому, одинаковому метаболизму в островковых клетках. Хотя результаты этих наблюдений указывают на стереоспецифичность действия глюкозы, согласно результатам более поздних иссле-

дований, -аномер служит более подходящим субстратом гликолиза в островковых

клетках, чем -аномер, причем стереоспецифичность играет роль на этапе, катализируемом изомеразой фосфоглюкозы [36]. Кроме того, в позднее проведенных исследованиях с йодацетатом были получены данные, которые на самом деле согласуются с метаболической гипотезой [37]. В механизме, с помощью которого гликолиз стимулирует секрецию инсулина, может принимать участие увеличение в клетке уровня НАД-Н и НАДФ-Н, равно как и концентрации R [38].

В процессе стимуляции секреции инсулина, как и во многих других внутриклеточных процессах, принимает участие цАМФ. Считается, что повышение уровня цАМФ выступает прежде всего в качестве положительного модулятора этапа секреции, чувствительного к глюкозе. Тот факт, что теофиллин (ингибитор фосфодиэстеразы) по-

вышает уровень цАМФ, но очень слабо влияет на секрецию инсулина в отсутствие глюкозы, свидетельствует о том, что само по себе увеличение цАМФ является недостаточным условием для стимуляции секреции инсулина.

Рис. 10—14. Внутриклеточная последовательность стимулирующего эффекта глюкозы на секрецию инсулина клеткой. Проникновение глюкозы в клетку усиливает гликолиз и повышает уровень цАМФ. Эти сдвиги приводят к увеличению внутриклеточного содержания кальция, «запускающего» выброс инсулина.

Как уже отмечалось, конечным этапом триггерного механизма, с помощью кото-

рого глюкоза или другие стимулы приводят к высвобождению инсулина из -клеток, считается увеличение внутриклеточного уровня кальция. Эти изменения кальциевого баланса определяются тормозящим влиянием глюкозы на выход кальция из клетки и мобилизацией внутриклеточных запасов кальция под влиянием цАМФ. На значение изменений внутриклеточного кальция отчетливо указывают результаты исследований с ионофорами—молекулами, действующими в качестве мембранных переносчиков ионов. В присутствии гетероциклической монокарбоновой кислоты А23187 — специфического ионофора двухвалентных катионов, который транспортирует кальций через биологиче-

ские мембраны, добавление кальция к -клеткам приводит к «всплеску» секреции инсулина даже без повышения уровня глюкозы или внутриклеточного уровня цАМФ [39].

Общую цепь событий можно суммировать следующим образом проникновение глю-

козы в -клетку усиливает гликолиз, вследствие чего повышается уровень восстановленных пиридиновых нуклеотидов (НАД-Н и НАДФ-Н) и содержание цАМФ. Эти изменения приводят к накоплению кальция, который «запускает» высвобождение инсулина

(рис. 10—14).

Характерной особенностью реакции инсулина на глюкозу является ее двухфазность (рис. 10—15). Начальный быстрый «всплеск» секреции начинается в пределах 1 мин после введения глюкозы, достигает максимума в пределах 2 мин и снижается в последующие 3—5 мин. Вторая фаза, характеризующаяся более постепенным приростом уровня инсулина, начинается спустя 5— 10 мин после начала инфузии глюкозы и продолжается в течение

Рис. 10—15. Концентрации иммунореактивного инсулина в плазме крови из воротной и периферической вены до внутривенного введения глюкозы и после него. Натощак концентрация инсулина в плазме воротной вены (1) в 3 раза превышает его уровень на периферии (2), а сразу же после введения глюкозы может превышать периферический уровень в 10 раз (7 наблюдений). Изменения концентрации инсулина в плазме воротной вены указывают на двухфазность реакции клеток, в ходе которой резкое увеличение выброса инсулина сменяется более медленным и длительным приростом его (по Blackard W. G., Nelson N. С., Diabetes, 1970, 19, 302).

последующего часа. В опытах на перфузируемой поджелудочной железе ингибитор синтеза белка пуромицин ослабляет выраженность второй фазы, но не влияет на

раннюю фазу секреции инсулина. Эти данные позволили предположить, что в -клетке содержатся два пула инсулина [40]. Остро высвобождаемый пул, содержащий ранее синтезированный инсулин, быстро опустошается в 1-ю фазу секреции. Второй хронический высвобождаемый пул, содержащий вновь синтезируемый инсулин и небольшие количества проинсулина, пополняющие запасы преформированного инсулина, постепенно опустошается во 2-ю фазу. Глюкоза стимулирует синтез инсулина на посттранскрипционном уровне независимо от синтеза новых молекул мРНК [41].

Гормоны желудочно-кишечного тракта

Еще в 1906 г. Мооге и др. [42] предположили, что двенадцатиперстная кишка производит «химический раздражитель внутренней секреции поджелудочной железы». Впоследствии и La Вагге обнаружил гипогликемическую реакцию на введение неочищенных препаратов секретина и в 1926 г. постулировал существование «инкретина» — фактора, продуцируемого желудочно-кишечным трактом и стимулирующего внутреннюю секрецию поджелудочной железы. В дальнейшем интерес к «инкретинам» резко понизился, пока исследования с применением радиоиммунологических методов не продемонстрировали, что реакция инсулина плазмы на пероральную нагрузку глюкозой в 2 раза или более превосходит его реакцию на внутривенную нагрузку, несмотря

Рис. 10—16. Реакция инсулина плазмы на гипергликемию, вызванную введением глюкозы внутрь. Гипергликемию вызывали и поддерживали на постоянном уровне (1) путем изменения скорости внутривенной инфузии глюкозы. Через 60 мин внутрь вводили дополнительно порцию глюкозы при поддержании того же уровня ее в крови. Несмотря на постоянство уровня глюкозы в плазме, содержание инсулина после пероральной на-