2.2 Строение рнк и ее синтез.

Строение

РНК – это линейная полинуклеотидная молекула, отличающаяся от ДНК в двух отношениях. Ао-первых, моносахаридом в РНК является рибоза, содержащая не одну, а две гидроксильные группы; они связаны с 2’- и 3’-атомами углерода. Во-вторых, место тимина в РНК занимает урацил (U). Большинство молекул РНК одноцепочечные, хотя часто в них имеются взаимнокомплементарные участки, образующие двухцепочечные структуры – “шпильки”. Спаривание оснований происходит также, как в ДНК, за исключением того, что вместо пары А-Т образуется А-U.

Существует три основных типа РНК:

1. Информационная (мРНК) – содержит информацию о последовательности аминокислот белка.

2. Рибосомная (рРНК) – имеется два типа: более крупная рРНК образует с белками комплекс, называемый большой рибосомной субъединицей; рРНК меньшего размера – комплекс, называемый малой рибосомной субъединицей. Во время синтеза большая и малая рибосомные субъединицы объединяются с образованием рибосомы.

3. Транспортная (тРНК) – малые, состоящие из приблизительно 80 нуклеотидов, молекулы с консервативной третичной структурой. Они переносят специфические аминокислоты в место синтеза пептидной связи в рибосоме.

Синтез

Синтез РНК на ДНК-матрице называется транскрипцией. У эукариот мРНК, рРНК и тРНК транскрибируются разными РНК-полимеразами. Транскрипция во многом сходна с репликацией.

Этапы транскрипции:

1. Инициация – образуется комплекс РНК полимеразы и ДНК на участке (промоторе) вблизи нуклеотида, с которого начинается транскрипция. Спираль ДНК на расстоянии около 13 пар нуклеотидов от точки старта транскрипции плавится, то есть цепи ДНК отделяются друг от друга.

2. Элонгация – РНК-полимераза копирует участок ДНК, комплементарно соединяя друг с другом рибонуклеотиды.

3. Терминация –остановка транскрипции, может быть вызвана CG-богатыми участками ДНК, образуются РНК-шпиличные структуры, или при участии терминирующего транскрипцию белка.

2.3 Регуляция генной экспрессии у эукариот. Современные представления о гене как единице наследственности.

Система регуляции экспрессии генов у эукариот связана с особенностями функционирования эукариотического генома. Ядро явилось важнейшим эволюционным приобретением эукариот. Благодаря ядерной мембране, разделяются зоны транскрипции и трансляции, что позволяет осуществлять сложную и многообразную регуляцию экспрессии генов. Такая регуляция происходит на всех этапах.

Регуляция на уровне транскрипции. Основным уровнем регуляции экспрессии у эукариот является регуляция на уровне транскрипции. Варианты такой регуляции весьма разнообразны.

Большое значение в регуляции экспрессии генов у эукариот придается фактору метилирования ДНК внутри регуляторных областей. Метилированию подвергается цитозин в составе ЦГ-динуклеотида, что обычно приводит к инактивации гена. Деметилирование ДНК восстанавливает активность. Этот важный процесс регулируют ферменты метилтрансферазы.

Частным случаем регуляции на уровне транскрипции является гормональная регуляция, при которой гены «включаются» в ответ на внешний сигнал. Сигнал запускает экспрессию только тех генов, которые имеют специфические последовательности ДНК в своих регуляторных областях.

Регуляция на уровне процессинга. У эукариот транскрипция гена еще не означает его проявления в фенотипе. Молекулы РНК, синтезированные в ходе транскрипции, у эукариот подвергаются существенным модификациям. Совокупность таких преобразований и составляет сущность процессинга.

На уровне процессинга в первую очередь необходимо отметить механизм альтернативного сплайсинга, позволяющий изменять порядок сшивки экзонов. Таким образом, на основе одной и той же нуклеотидной последовательности одного гена формируются разные белки, состоящие из разных сочетаний одних и тех же аминокислотных блоков.

Другим интересным способом регуляции на уровне процессинга является тканеспецифическое редактирование РНК. Оно обнаружено у микроорганизмов, грибов, млекопитающих и проявляется заменой отдельных нуклеотидов в молекуле РНК при помощи специального ферментного комплекса. Если в случае замены вместо смыслового кодона образуется стоп-кодон, то в новой полипептидной цепи будут отсутствовать все аминокислоты, идущие после него. Получается белок с совершенно новыми свойствами.

Регуляция на уровне трансляции. Механизмы регуляции экспрессии на уровне трансляции изучены недостаточно полно. Избирательная трансляция м-РНК осуществляется отбором определенных м-РНК путем блокировки доступа к рибосомам. В случае избирательной стабилизации определенных типов м-РНК в цитоплазме, они не подвергаются распаду после трансляции.

Регуляция на уровне посттрансляционной модификации белка. Посттрансляционная модификация полипептида и превращение его в функционально активную молекулу белка завершает процесс реализации генетической информации. Она представляет собой различные модификации определенных аминокислот (фосфорилирование, ацетилирование), удаление некоторых из них, и на этой основе формирование вторичной, третичной, четвертичной структуры белка. На посттрансляционном уровне также возможна регуляция экспрессии. Широко распространен механизм регуляции активности ферментов, основанный на присоединении молекул-эффекторов, в роли которых часто выступают конечные продукты биосинтеза.

Ген, или наследственный фактор — это участок молекулы ДНК (у многих вирусов РНК), кодирующий первичную структуру полипептида, молекулы транспортной или рибосомной РНК. В то же время каждый ген характеризуется рядом специфических регуляторных последовательностей ДНК, таких как промоторы, которые принимают непосредственное участие в регулировании проявления гена. Таким образом, понятие гена не ограничено только кодирующим участком ДНК, а представляет собой более широкую концепцию, включающую в себя и регуляторные последовательности.

Ген – функциональная единица наследственности. Он играет важную роль в наследовании признаков разными организмами. На генном уровне организации наследственного материала обеспечиваются индивидуальное наследование и индивидуальное изменение отдельных признаков и свойств клеток, организмов данного вида.

2.4 Доказательства хранения и передачи генетической информации нуклеиновыми кислотами (эксперименты Ф. Гриффитса с пневмококками; эксперименты Н. Цандлера (Циндера) и Дж. Ледерберга с сальмонеллой). Конъюгация, трансдукция и трансформация микроорганизмов.

В 1869 г. швейцарский химик Ф. Мишер обнаружил в клеточном ядре особые в-ва, обладающие св-вами кислот. Он дал им название нуклеиновых кислот. Долгое время они не привлекали внимание исследователей. И только после того как в опытах английского бактериолога Ф. Гриффита (1928) была продемонстрирована способность пневмококков к трансформации, было выдвинуто предположение о том, что “трансформирующий агент”, отождествляемый с “веществом наследственности” находится в ядре. Суть эксперимента Гриффита заключалась в следующем. При введении мышам непатогенных штаммов пневмококков животные не заболевали (Б). При введении патогенных микробов, убитых нагреванием, мыши оставались здоровыми (В). Гриффит показал, что при одновременном введеии лживых непатогенных и убитых патогенных микробов мыши погибали (Г). Гриффит заключил, что живые микробы непатогенного штамма приобретают наследственно закрепленные св-ва патогенности (трансформируются). В последующем было доказано, что трансформация происходит не только в живом организме, но и в пробирке.

В 1952 г. Н. Циндер и Дж. Ледерберг описали еще один способ передачи наследственной информации у бак­терий. Исследования проводились на бактериях мышиного тифа Salmonella fyphimurium. В U-образную трубку с бактериальным фильтром посередине засевались на полную питательную среду 2 штамма: в одну часть пробирки штамм 22А (ауксотрофный по мутации, тормозящей синтез триптофана Т-; это требовало добав­ления данной аминокислоты в среду для культивирования), в другую — штамм 2А дикого типа (способен син­тезировать триптофан Т+). Совместное выращивание двух штаммов бактерий мышиного тифа привело к тому, что через некоторое время при посеве на минимальную среду бактерии штамма 22А дали небольшое количество колоний. Следовательно, они каким-то образом приобрели способность синтезировать триптофан. Переход бактерий из одного колена пробирки в другое преграждался бактериальным фильтром, а возможность обратной мутации штамма 22А исключалась, так как он был стабильным в этом отношении. По мнению Циндера и Ледерберга, перенос информации осуществлялся фагом. Было установлено, что ДНК-содержащие вирусы (фаги) делятся на две группы: паразиты, приводящие к гибели бактериальные клетки, и умеренные (симбиотические), не вызывающие заболевания и разрушения клеток. Умеренные вирусы, или профаги, существуют в клетке в виде ДНК, интегрированной с ДНК бактерии, и реплицируются вместе с ее хромосомой. Явление такого сосуществования умеренного фага и бактерии носит название лизогении.

Конъюгация – однонаправленный перенос части генетического материала (плазмид или бактериальной хромосомы) при непосредственном контакте двух бактериальных клеток. Посредством конъюгации бактерии обмениваются генетическим материалом, поддерживая свое генетическое разнообразие.

(Здесь процесс конъюгации для E. coli) В большинстве случаев конъюгация возможна лишь тогда, когда у донорской клетки есть плазмида, содержащая гены, обеспечивающие передачу ДНК. У E. coli (и других грамотрицательных бактерий) физический контакт между двумя клетками обеспечивается половыми пилями. Они взаимодействуют с рецепторами на поверхности клетки-реципиента, за счет чего конъюгирующие клетки образуют пару. В ДНК клетки-донора происходит разрыв, хеликаза расплетает цепь и вся цепь 5’-концом идет в клетку-реципиент, другой конец удлиняется, восполняя уходящую цепь. Перенесенная в реципиент ДНК также достраивается до двухцепочечной.

Трансдукция – процесс переноса бактериальной ДНК из одной клетки в другую бактериофагом. Ключевой этап процесса – упаковка переносимой ДНК в головку фага во время литической фазы его жизненного цикла, т.е. когда клетка погибает и вирусные частицы выходят наружу. При сборке вирусных частиц помимо собственной ДНК, попадают частицы бактериальной ДНК (по ошибке). Фаговые частицы с бактериальной ДНК называют трансдукционными частицами. К трансдукции способны лишь фаги, вызывающие фрагментацию ДНК на фрагменты нужного размера, чтобы они поместились в капсид.

Трансформация – процесс поглощения бактериальной клеткой молекулы ДНК из внешней среды. Для того, чтобы быть способной к трансформации, клетка должна быть компетентной, т.е. молекулы ДНК должны иметь возможность проникнуть в нее через клеточные покровы. Сначала компетентные клетки связывают ДНК своей поверхность с помощью рецепторов. ДНК расщепляется нуклеазами на фрагменты, причем в клетку попадает одна из двух цепей. После попадания в клетку одноцепочечный фрагмент встраивается в геномную ДНК клетки-реципиента.