III. Фракционное высаливание белков. Разделение альбуминов и глобулинов

Ход работы: к 1 мл раствора белка добавляют равный объем (1 мл) насыщенного (50%) раствора сульфата аммония, хорошо перемешивают и оставляют на 10 мин для более полного осаждения белка. Через 10 минут образовавшийся осадок отфильтровывают через складчатый фильтр. В фильтрат добавляют крупинки кристаллического сульфата аммония до появления осадка (образуется 100% р-р сульфата аммония).

Результаты

№ пробирки	Субстрат	Степень насыщения раствора сульфата аммония	Результат	Какой белок выпадает в осадок
1. 2.

Вывод:

Iy.Электрофорез

В плазме крови человека содержится 65-85 г/л белка, представленного различными про своему происхождению и свойствам фракциями. При различных острых и хронических заболеваниях, а также в результате действия многих повреждающих факторов внешней среды, таких как тяжелые металлы, окислители, органические растворители, хлорпроизводные, фосфорорганические соединения, вибрация, ультразвук и т.д. происходит изменение содержания в крови не только общего белка, но и белковых фракций (диспротеинемия). Выявление таких изменений имеет существенное клинико-диагностическое значение.

В разделении белковых фракций сыворотки крови основное значение принадлежит электрофорезу. Принцип этого метода основан на способности заряженных частиц (в том числе белков) перемещаться под действием электрического поля в зависимости от знака их заряда.

Скорость движения частиц в электрическом поле зависит от:

1. величины суммарного заряда частиц

2. размера и формы частиц

3. силы электрического тока и напряжения

4. свойств носителя, на котором проводят разделение

5. рН буферного раствора

6. температуры.

Виды электрофореза:

1. По направлению движения частиц основными являются два вида электрофореза горизонтальный и вертикальный.

2. По приборному оформлению:

- на пластинках;

- в трубочках

- в колонках

- капиллярный

3. По используемому носителю:

- на бумаге;

- на ацетатцеллюлозных мембранах;

- в геле (крахмальном, агарозном, полиакриламидном);

- без поддерживающей среды.

4. По интенсивности электрического поля:

- низковольтный (при используемом напряжении < 500 В)

- высоковольтный (при напряжении > 500 В)

Техника электрофореза впервые была предложена Тизелиусом в 1937 году.

Для проведения электрофореза требуются: источник постоянного тока и камера, заполненная буфером. Камера состоит из двух сообщающихся отделений: в одном находится электрод, в другом – конец поддерживающей среды, на которую наносится исследуемый материал (сыворотка крови).

Выбор буферного раствора определяется характером заряда исследуемых веществ. Для разделения сывороточных белков используют буферы с рН=8,6 (например, мединал-вероналовый). При такой величине рН молекулы белка заряжены отрицательно и их движение направлено к аноду.

В качестве поддерживающей среды для электрофореза используются:

1. Фильтровальная бумага: разделение проводится при низком напряжении поля, поэтому длится 16-18 часов, границы между отдельными фракциями получаются нечеткими, можно получить 5 основных белковых фракций сыворотки крови.

2. Пленки из ацетатцеллюлозы: дорогостоящие, разделение занимает меньше времени (30-40 минут), более эффективно. Получают также 5 фракций.Широко применяется для разделения и идентификации липопротеинов, изоферментов, гемоглобинов и для разделения белков мочи

3.Агар или агарозный гель представляют собой гетерополисахариды, менее дорогостоящие, чем ацетатцеллюлозные пленки, по эффективности не уступают им, разделение занимает около 90 минут; используются также при иммуноэлектрофорезе.

4. Крахмальный гель: обладает всеми преимуществами других гелей, характерен эффект молекулярного сита; используется, в основном , для предварительного разделения смеси белков.

5. Полиакриламидный гель: наиболее широко применяется; обладает высоким эффектом молекулярного сита; высокая эффективность разделения; можно получить до 20 белковых фракций сыворотки крови и более.

Этапы электрофореза:

1. Смоченную в буфере поддерживающую среду (носитель) помещают в камеру, заполненную буфером, и наносят на нее исследуемые пробы.

2. Подключают электроды и пропускают электрический ток и в течение определенного времени (зависит от поддерживающей среды) проводят разделение.

3. Фиксация проб с помощью ацетона, метанола или высокой температуры.

4. Окрашивание проб с помощью красителей (амидо черный, бромфеноловый синий, пунцовый S).

5. Удаление избытка красителя. Промывка электрофореграмм.

6.Определение процентного содержания фракций белка

- Сканирование электрофореграмм с помощью денситометра. В денситометре свет проходит через гель, поглощение света прямопропор-ционально количеству белка.

- Еще одним методом является элюирование окраски из основы с последующим колориметрическим измерением поглощения растворов. Но этот метод более трудоемкий и менее точный, и в настоящее время не используется в клинической практике.

7. Оценка полученных результатов.

В сыворотке крови человека в норме содержится альбумины – 55-65%; глобулины a₁-2-5%; глобулины a₂ –6-11%; глобулины b -11-15%; глобули-

ны g - 15-22%.