3.2 Микроскопическое и микробиологическое исследование образцов колбасы варёной Филейской «Вязанка»

Второй этап исследований – определение бактериологической обсемененности готового колбасного изделия.

Проводили микроскопическое исследование мазков-отпечатков всех изученных образцов. Затем осуществляли микробиологическое исследование, включающее в себя исследование на определение количества КМАФАнМ, БГКП, индикацию сальмонелл, S.aureus и СРК.

Микроскопические исследования образцов колбасы варёной Филейской «Вязанка» проводили сразу после закуп ки образцов. Для исследований использовались простерилизованные в автоклаве инструменты (скальпели, пинцеты), а также стерильная посуда.

Для приготовления мазка-отпечатка из поверхностного слоя колбасы вырезали кусочек и срезанной стороной прикладывали к поверхности профламбированного и охлажденного предметного стекла (рис. 3).

Рисунок 3. Приготовление мазка-отпечатка колбасы варёной Филейской «Вязанка»

Для приготовления мазка-отпечатка из глубинных слоев колбасы поверхность колбасы прижигали шпателем, делали разрез, из глубины извлекали кусочек колбасы и прикладывали его к поверхности стекла. Препараты – отпечатки высушивали на воздухе. Фиксировали над пламенем горелки, окрашивали по Граму и микроскопировали (рис. 4).

Рисунок 4. Окрашивание по Граму мазка-отпечатка колбасы варёной Филейской «Вязанка»

Просматривали не менее пяти полей зрения, в каждом поле подсчитывали кокковые и палочковидные формы микроорганизмов. Среднее количество микробов определяют путем сложения всех клеток и деления их на число полей.

В результате исследования мазков – отпечатков были получены следующие результаты (табл. 3). Подавляющее большинство образцов оказалось свободными от бактериальной обсемененности. Просмотр всех полей зрения позволил увидеть только жировые включения и микрочастицы фарша. Некоторое количество палочковидных и кокковидных микроорганизмов было обнаружено в мазках-отпечатках кусочков, взятых с поверхности и из центра батонов образцов М2 №2. Визуально палочковидные микроорганизмы идентифицированы как бактерии рода Bacillus и бактерии рода Staphylococcus.

Таблица 3 – Результаты микроскопического исследования мазков-отпечатков колбасы варёной Филейской «Вязанка»

Происхождение и номер образца колбасного изделия	Показатели
	Кокки	Палочковидные	Количество микроорганизмов/5 полей зрения		Вывод
			в поверхностном слое	в центре батона
М1, №1	не обнаружены	не обнаружены	-	-	Соответствует
М1, №2	не обнаружены	не обнаружены	-	-	Соответствует
М2, №1	не обнаружены	не обнаружены	-	-	Соответствует
М2, №2	не обнаружены	обнаружены	13,6	3,6	не соответствует
П1, №1	не обнаружены	не обнаружены	-	-	Соответствует
П1, №2	не обнаружены	не обнаружены	-	-	Соответствует
П2, №1	не обнаружены	не обнаружены	-	-	Соответствует
П2, №2	не обнаружены	не обнаружены	-	-	Соответствует
Л1, №1	не обнаружены	не обнаружены	-	-	Соответствует
Л1, №2	не обнаружены	не обнаружены	-	-	Соответствует
Л2, №1	не обнаружены	не обнаружены	-	-	Соответствует
Л2, №2	не обнаружены	не обнаружены	-	-	Соответствует

При микробиологическом исследовании колбасы были проведены исследования на определение количества КМАФАнМ, БГКП, индикацию сальмонелл, S. aureus и СРК.

Для определения количества КМАФАнМ в одну чашку Петри производили посев 0,1 г, в другую – 0,01 г продукта. Предварительно готовили 10-кратное разведение испытуемой взвеси. Стерильной пипеткой с широким концом брали 5 мл испытуемой взвеси и переносили ее в пробирку с 5 мл стерильного физиологического раствора. В 1 мл полученного раствора содержится 0,1 г продукта. Другой стерильной пипеткой содержимое пробирки перемешивали продуванием. Брали 1 мл и переносили в чашку Петри с МПА, слегка приоткрывая крышку. Для посева 0,01 г продукта готовили второе разведение – 1:100 и также высевали в чашку Петри. Чашки Петри помещали в термостат при 37°С на 48 ч. После истечения 48 ч подсчитывали количество колоний бактерий, выросших на поверхности и в глубине агара.

При определении общего количества КМАФАнМ в 1 г продукта подсчитанное количество колоний умножали на степень разведения продукта по каждой чашке и выводили среднее арифметическое результатов подсчета двух чашек с разной массой продукта.

Результаты определения общего количества КМАФАнМ представлены в табл. 4.

Таблица 4 – Результаты определения общего количества КМАФАнМ в образцах колбасы варёной Филейской «Вязанка»

Происхождение и номер образца колбасного изделия	КМАФАнМ, КОЕ/г	Вывод
М1, №1	<1,0·103	Соответствует
М1, №2	<1,0·103	Соответствует
М2, №1	<1,0·103	соответствует
М2, №2	3,1·103	не соответствует
П1, №1	<1,0·103	Соответствует
П1, №2	<1,8·103	Соответствует
П2, №1	<1,0·103	Соответствует
П2, №2	<1,0·103	Соответствует
Л1, №1	1,5·103	Соответствует
Л1, №2	<1,0·103	Соответствует
Л2, №1	<1,0·103	Соответствует
Л2, №2	<1,0·103	Соответствует

Из типичных колоний посева образца М2 №2 были выделены чистые культуры на скошенный агар, из которых впоследствии были приготовлены микропрепараты. Микроскопия препаратов позволила обнаружить два основных варианта микроорганизмов: палочковидные бактерии, образующие споры (предположительно, рода Bacillus) и кокковые формы, грамположительные, которые впоследствии были изучены дополнительно (рис. 5, 6).

Рисунок 5. Препарат бактерий рода Bacillus (увеличение 15х90, иммерсия)

Рисунок 6. Препарат грамположительных кокков (возможно Staphylococcus) (увеличение 15х90, иммерсия)

Для определения БГКП проводили высев на среду Хейфица. Среду Кесслера и посев на дифференциально-диагностическую среду Эндо.

При исследовании на БГКП среда Хейфеца не дала салатно-зеленого цвета, а в среде Кейслера не образовалось пузырьков газа, при окончательном заключении на посевах в чашках Петри со средой Эндо характерных темно-красных с металлическим блеском колоний выявлено не было. Этот говорит об отсутствии обсемененности колбасных изделий колибактериями.

При исследовании на S.aureus делали микроскопические препараты из подозрительных колоний (рис. 7).

Рисунок 7. Приготовление микропрепарата из подозрительной на принадлежность к S.aureus колоний

Подозрительными считали выпуклые круглые с ровными краями колонии S-формы, которые выявили по одной-две в посеве каждого опытного образца. В микропрепаратах, окрашенных по Граму, обнаружена грамположительная кокковая флора, однако реакция плазмокоагуляции дала отрицательный результат. Таким образом, было сделано заключение, что коагулазопозитивный S.aureus в пробах не обнаружен.

При исследовании на сульфатредуцирующих клостридий (СРК) делали посев из всех разведений на среду Вильсона-Блера. Посевы инкубировали в термостате при 37°С в течение 20 часов. При просмотре посевов черных колоний или сплошного почернения обнаружено не было, что говорит об отсутствии клостридий в продукте.

При индикации сальмонелл на среде Эндо выделили от 1-й до 3-х характерных колоний в каждом образце и отвили их на трехсахарный агар. На трехсахарном агаре цвет скошенной поверхности был розовый, столбик желто-красный. При исследовании препарата «висячая капля» и фиксированного препарата, окрашенного по Граму, подвижных грамотрицательных палочек не обнаружили. Обнаруженные микроорганизмы не давали характерный рост на элективной среде, лактозу и сахарозу ферментировали, сероводород не образовывали. Исследование указывает на отсутствие бактерий из рода сальмонелл.

Таким образом, проведя органолептическое и микробиологическое исследования колбасы варёной Филейской «Вязанка», мы выяснили, что грубых нарушений ГОСТа и технического регламента Таможенного союза "О безопасности мяса и мясной продукции" не наблюдается (табл. 7). Однако образец М2 №2 характеризовался повышенной микробной обсемененностью и наличием палочковидной и кокковой микрофлоры. При этом патогенных микроорганизмов выявлено не было. Возможно нарушение условий хранения продукта в торговой точке.

Таблица 7 - Результаты бактериологического исследования колбасы варёной Филейской «Вязанка»

Наименование показателей, единицы измерений	Методы испытаний	Значение показателей по НД	Фактическое значение
Технический регламент Таможенного союза ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции».
Микробиологические показатели
Патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы, г	ГОСТ 31659 -2012	не допускаются	Не обнаружены
БГКП, г	ГОСТ 31747-2012	не допускается в 1,0	не обнаружены в 1,0
S.aureus, г	ГОСТ 31746-2012	не допускается в 1,0	не обнаружены в 1,0
Сульфит-редуцирующие клостридии, г	ГОСТ 29185-2014	не допускается в 0,1	не обнаружены в 0,1
КМАФАнМ, КОЕ/г	ГОСТ 10444.15-94	не допускается >2,5·103	Превышение обнаружено в 1-м образце из 12-ти изученных