книги из ГПНТБ / Овчинников, А. И. Биохимия молока и молочных продуктов

образования щавелевоуксусиой кислоты в молочной железе еще до конца не выяснены. Как известно, щавелевоуксусиая кислота может получиться при окислении яблочной кислоты и карбоксилировании пнровиноградной кислоты:

1. СООН — СИОН— CHZ— СО ОН-^ ^ » с о о н —с о —с н 2— с о о н ,

ки с л о т а

—*- СООН — с о — с н г— СООН + АДФ + (Р)

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА МОЛОКА

Ферменты

Ферменты есть термолабильные вещества белковой природы, образующиеся в клетке и ускоряющие процессы гидролиза и синтеза'веществ, т. е. обладающие каталитическими свойства­ ми. Действие ферментов зависит от целого ряда факторов: тем­ пературы, pH среды, активаторов и ингибиторов [165, 166].

В молоке содержатся ферменты, встречающиеся в природе. Они попадают в молоко из молочной железы [90, 337, 338, 430, 453], с микроорганизмами из воздуха, с посуды, рук и других источников, а также специально вносятся с культурами молоч­ нокислых бактерий, дрожжами, плесенями или в виде препара­ тов (сычужный фермент, пепсин) при изготовлении молочных продуктов [121].

Все ферменты молока и ферменты, применяемые в качестве препаратов в молочной промышленности, можно разделить в со­ ответствии с рекомендациями комиссии по ферментам Международного ‘биохимического союза на шесть классов: окси­ доредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы и лигазы (синтетазы). Гидролазы, т. е. гидролитические фермен­ ты имеют особенно важное производственное значение, поэтому они рассматриваются в первую очередь.

Г и д р о л а з ы (3)

Гидролазы катализируют расщепление различных ддожиых органических соединений при участии воды.

Гидролазы в свою очередь подразделяются на эстеразы, карбогидразы и протеазы.'

70

Эстеразы (3.1).- Это ферменты, которые катализируют реак­ ции расщепления и синтеза сложных эфиров в соответствии с уравнением:

При нормальной функции молочной железы в молоко попадает незначительное количество «нативной» липазы. Действие этой липазы может проявляться в щелочной среде при pH 7—8,8 (в настоящее время в молоке обнаружена липаза, активная при pH 5,0—6,0 [294]). Поэтому при благоприятных условиях липаза может вызвать частичное разложение жира в молоке, молочных продуктах (сухое сгущенное молоко, сыр) и придать им горький вкус.

По данным Тарасюка, в молоке липаза находится в двух формах — плазменная липаза, связанная с казеином (х-фрак- цней), и мембранная, адсорбированная на поверхности жировых шариков [430J.B обычном молоке липаза главным образом связана с казеином (около 90%) [90, 314, 315, 420, 430], отделе­ ние ее от белка и адсорбирование на жировых шариках может произойти при обработке молока — перекачивании, гомогениза­ ции, пастеризации и др. В молоке, склонном'к прогорканию (в конце лактации, при особых рационах кормления -животных и т. д.) адсорбирование лйпазы на Жировых шариках происхо­ дит при охлаждении, что приводит к самопроизвольному липолизу.

Липазы, выделяемые микрококками, Вact. fluorescexis, пле­ сенями Penicillium, Aspergillus и др., обладают высокой липо­ литической активностью и действуют при более низких pH, чем липаза молочной железы. При попадании этих видов микро­ организмов в молоко, сливочное млело и другие молочные

71

продукты происходит гидролитическое разложение жира и появ­ ление горечи.

Как бактериальные липазы, так и липаза молочной железы по сравнению с другими ферментами отличаются своей термоустойчивостью и выдерживают обычную температуру пастери­ зации [254, 274, 327]. Для инактивации липазы требуется темпе­

ибольшинство ферментов, разрушается при более низких тем­ пературах (около 70°С). Но она хорошо растворяется в жирах

исвободно проникает в жировые шарики молока и сливок, поэтому при моментальной пастеризации (72—75° С) жир не ус­ певает полностью нагреться до температуры инактивации фер­ мента и липаза частично остается неразрушенной.

Фосфатазы (3.1.3.9) имеют очень широкое распространение в природе. Практически фосфатазы содержатся во всех живых клетках и биологических жидкостях, в особенности таких, как костная ткань, молоко, лейкоциты, эритроциты, печень, плазма крови, плесени, дрожжи и др. Фосфатазы катализируют гидро- л'итическое расщепление ряда органических соединений: глице­ рофосфата, диоксиацетонфосфата, глкжозо-1-фосфата, глюкозо­ б-фосфата, фруктозодифосфата, лецитина и др. Реакция идет по следующей схеме:

О

В молоке обнаружены щелочная и кислая фосфатазы [141, 257, 303, 335, 338, 383]. Щелочная фосфатаза молока действуетпри pH 9,0—10,0, кислая — при pH 4,0—4,3. Фосфатазы попада­ ют в молоко непосредственно из молочной железы. Основной фосфатазой является щелочная, кислой фосфат'азы в молоке мало. Предполагают, что щелочная фосфатаза содержится в оболочках жировых шариков, кислая связана с альбуминовой фракцией белков. Щелочная фосфатаза молока чувствительна к повышенной температуре. 30-минутное нагревание молока при 63° С или моментальная пастеризация 'при 80° С полностью раз­ рушают ее. Высокая чувствительность фосфатазы к нагреванию дала возможность разработать метод контроля степени пастери­ зации молока. Наиболее простая методика заключается в рас­ щеплении фенолфталеинфосфата натрия фосфатазой молока (при pH 9,8—9,0) с освобождением фенолфталеина, окрашиваю­ щего молоко в розовый цвет [133]. Большей чувствительностью

72

к фосфатазе обладают паранитрофенилфосфат бария и динатриевая соль паранитрофенилфосфата [226].

Отмечено- [257, 371, 394], что фосфатаза обладает способно­ стью к реактивации при хранении молока и сливок после крат­ ковременной высокотемпературной пастеризации. При хранении молока и молочных продуктов возможно выделение фосфатазы некоторыми бактериями. Фосфатаза бактериального происхож­ дения изучена еще мало и сведений о ней в литературе почти не имеется.

Карбогидразы (3.2). Это большая группа ферментов, ката­ лизирующих гидролитическое разложение и синтез гликозидов,

Всвежем молоке находятся два представителя карбогидраз: р-галактозидаза (лактаза) и амилаза, которые попадают в него

непосредственно из молочной железы (лактазапоявляется в молоке главным образом вследствие развития в нем микро­

р-Галактозидаза, выделяемая молочной железой, не имеет практического значения, так как в молоко попадает в очень небольших количествах. Однако этот фермент образуется в больших количествах молочнокислыми бактериями, кишечной палочкой, молочными дрожжами, плесенями и другими микро­ организмами, попадающими в молоко из воздуха и других источников. Оптимум действия р-галактозидазы проявляется при температуре 35—45° С и pH 6,5—8,0, молекулярный вес ее около 20 000.

Амилаза катализирует гидролитическое расщепление крах­ мала до декстринов и мальтозы. В молоке,содержатся р-амила- за (3.2.1.2) и а-амилаза (3.2.1.1) [337]. Они попадают в молоко

.из молочной железы. Оптимум действия амилаз.— 45°С и pH 6,5—7,5. Нагревание молока до 58—65° С в течение 5 мин раз­ рушает содержащиеся в нем амилазы.

Протеазы (3.4). Катализируют гидролитическое расщепление

Согласно современной классификации и номенклатуре протеазы называют пептидгидролазами, но старые термины употребля­ ются и в настоящее время [165]. Протеазы разделяют на

73

протеиназы и пептидазы. Протеиназы катализируют расщепле­ ние белков, пептидазы — полипептидов и дипептидов. М. Берг­ маном установлено, что протеиназы могут расщеплять пептид­ ные связи не только в белках, но и в полипептидах и дипеп­ тидах.

К протеазам, применяемым в молочной промышленности, можно отнести протеазы молочной железы, микрофлоры молока и специально вносимые ферментные препараты животного н ра­ стительного происхождения (пепсин, трипсин, рениин и др.). Все протеазы в разной степени гидролизуют белки молока на пептоны, полипептиды и свободные аминокислоты, многие свер­ тывают молоко.

Протеазы молочной железы в свежем молоке были обнару­ жены Бабкоком и Русселем еще в 1897 г. Они попадают в моло­ ко непосредственно из молочной железы, по своему действию очень близки к трипсину. Оптимум действия протеазы молока проявляют в слабо щелочной среде и при температуре 37—42° С. В слабо кислой среде ферменты значительно снижают свою активность, поэтому белки молока практически ими не гидро­ лизируются. Протеазы, выделяемые молочной железой, стойки к нагреванию и инактивируются при температуре свыше 75° С. Имеются предположения, что эти протеазы участвуют в созре­ вании некоторых видов сыров.

Протеазы микрофлоры могут вырабатываться микрофлорой молока, которая попадает в'него из воздуха или другим путем, а также специально вносится при изготовлении некоторых мо­ лочных продуктов. Активные протеазы выделяются микрокок­ ками и гнилостными бактериями (Вас. subtilis, Вас. mesentericus, Вас. putrifucus и др.) [33, 34, 160, 259]. При их размно­ жении в молоке может появиться горький вкус и произойти свертывание молока при пониженной кислотности (30—35° Т) за счет выделения сычужного фермента. Микрококки могут играть положительную роль в сыроделии; выделяемый ими сы­ чужный фермент способствует ускорению созревания сыров.

Молочнокислые бактерии продуцируют менее активные про­ теазы, но им принадлежит главная роль в созревании сыров [146, 205, 262, 283]. Активность протеаз у разных видов штаммов молочнокислых . микроорганизмов неодинаковая, например, Lbm. casei синтезирует в своих клетках ферменты, обладающие высокой протеолитической способностью (протеиназы н пепти­ дазы), тогда как ферменты Str. cremoris и Str. lactis менее активны и состоят в основном йз протеиназ. Однако при сравне­ нии протеолитической активности отдельных штаммов бактерий необходимо принимать во внимание условия действия их, в осо­ бенности pH, Оптимум действия протеаз стрептококков лежит при pH 6,0—7,0, молочнокислых палочек при pH 5,7—6,0 (под­ робнее см. раздел «Распад белков»),

К протеолитическим ферментам животного происхождения

74

га. Представляет собой протеиназу, выделяемую слизистой обо­ лочкой желудка. Катализирует гидролитическое расщепление белков, в том числе и белков молока, а также полипептидов и дипептидов. Преимущественно расщепляет те пептидные связи, в образовании которых принимают участие аминные, группы тирозина и фенилаланина. Для производственных целей пепсин получают из желудков свиней в виде технического пре­ парата, активность которого зависит от степени его очистки. Поступающие в продажу препараты пепсина неоднородны по составу. Кристаллический пепсин является однородным белко­ вым веществом и обладает большой свертывающей способно­

ментом, или лабферментом, или химозином. Среди специалистов молочной промышленности он больше известен как сычужный фермент. Сычужный фермент вырабатывается в сычуге (четвер­ том отделе желудка) молодых телят. С возрастом сычужный фермент постепенно качественно изменяется и у взрослых животных вырабатывается фермент по своему действию близ­ кий к пепсину. Химозин обладает способностью свертывать молоко; подобно пепсину, обладает также протеолитическим действием, но расщепление казеина производит медленно и не­ глубоко.

Технический препарат сычужного фермента получают из вы­ сушенных сычугов молодых телят. Фермент эстрагируют из мел­ ко нарезанных сычугов подкисленным раствором поваренной соли и высаливают вместе с бедками поваренной солью. Осадок центрифугируют, смешивают с поваренной солью, высушивают и размалывают до порошкообразного состояния. Полученный порошок представляет собой технический препарат сычужного фермента (содержащий примеси пепсина и других протеолити­ ческих ферментов), активность которого соответствует 80 000—■ 100 000 единицам. Под активностью сычужного фермента пони­ мается количество единиц молока, которое свернется одной единицей фермента при температуре 37° С в течение 40 мин. Очищенный сычужный фермент обладает очень большой свер­ тывающей способностью. Пальмеру и Ханкинсону (США) уда­ лось получить кристаллический фермент, который имел актив­ ность 72 300 000 единиц. При большой свертывающей способно-- сти кристаллический сычужный фермент обладает незначитель­ ной протеолитической активностью [121, 146].

Сычужный фермент, по данным Г. Инихова, проявляет свою активность при pH' 5,2—6,3. При pH 7,5 и выше сычужный фер­ мент не действует, при pH 8,0 теряет свои ферментативные свойства. Сычужный фермент чувствителен к . температуре. Оптимальной температурой для его свертывающего действия

75

является 39—42° С, при 25° С фермент действует медленно, практически при этой температуре молоко не свертывается. Нагревание молока свыше 60° С увеличивает-длительность свер­ тывания. Сухой порошкообразный сычужный фермент довольно стоек и выдерживает нагревание выше 100° С.

Трипсин (3.4.4.4.) содержится в поджелудочной железе круп­ ного рогатого скота и свиней. Выпускается в виде препарата, известного под названием панкреатина. Применяется для полу­ чения ферментативного гидролизата казеина, обладающего легкой усвояемостью, изготовления пенообразующего препарата для кондитерской промышленности, специальных медицинских препаратов для вскармливания детей в грудном возрасте,, пита­ тельных сред в бактериологии и ,т. д. [107, 121, 286].

К протеолитическим ферментам растительного происхожде­ ния относятся ферментные препараты, получаемые из высших растений, грибов, плесеней и бактерий. Целый ряд растений и грибов, преимущественно растущих в южных районах Дашей страны, содержит протеиназы, способные свертывать молоко. К ним относят: инжир, чистотел, дынное, фиговое дерево, лож­ ные опята, сырный гриб, свинуху и многиедругие. Однако из большого числа растений только инжир (Ficus carica) и дын­ ное дерево (Carica papaus) содержат в.млечном соке достаточ­ ное количество ферментов. Ферментные препараты, полученные из этих растений под названием «фицина» и «папаина», приме­ няются в ряде стран.

Многие разновидности плесневых грибов вида • Aspergillus (Aspergillus oryzae, Aspergillus terricola, Aspergillus flavus)

обладают способностью продуцировать протеолитические и дру­ гие ферменты. Во ВНИМИ исследовались ферментные препа­ раты, выделенные из Asp. terricola и Asp. flavus. Активность очищенных препаратов составляла 117 000 и 145 870 единиц соответственно, т. е. достигала активности сычужного фермента животного происхождения. Оптимум действия сычужного фер­ мента плесневых грибов находится в пределах 50—55° С. Поми­ мо плесневых грибов, продуцируют сычужный фермент некотоные микроорганизмы: Вас. subtilis, Вас. .mesentericus и другие. Бактериальные-ферменты, как правило, наряду с высокой свер­ тывающей имеют и высокую протеолитическую активность, что, приводит к выработке сыра с горьким вкусом. Наиболее перспективными для молочной промышленности являются фер­ ментные препараты плесневых грибов.

О к с и д о р е д у к т а з ы (1)

. Это большая группа ферментов, катализирующих окнслительно7восстановительные реакции в живых организмах. К ним относятся дегидрогеназы, цитохромы и гидропероксидазы. Среди этих. ферментов наибольшее значение имеют дегидрогеназы.

76

которые катализируют реакции дегидрирования, т. е. отнятия водорода от окисляемого субстрата.

Дегидрогеназы. Ферменты дегидрогеназы подразделяются на анаэробные дегидрогеназы, переносящие водород на промежу­ точные вещества, и аэробные дегидрогеназы, переносящие водо­ род. на кислород.

Анаэробные дегидрогеназы относятся к двухкомпонентным ферментам, имеющим в качестве активной группы (кофермента) НАД и НАДФ.

НАД (никотинамидадениндинуклеотид) и НАДФ (никотинамидадениндинуклеотидфосфат) имеют следующее химиче­

НАД

Анаэробная дегидрогеназа отнимает водород от ряда органиче­ ских соединений, например, от фосфоглицеринового альде-: ' гида, при этом НАД превращается в свою восстановленную

77

гера). Этот фермент производит быстрое обесцвечивание мети­ леновой сини в присутствии формальдегида, так как последний окисляется им в муравьиную кислоту, а отнятый водород пере­ носится на метиленовую синь:

х о н

где МС — метиленовая синь; МСН2— бесцветная форма мети­ леновой сини.

Наличие альдегиддегидразы в молоке не связано с микро­ флорой, она попадает в молоко непосредственно из молочной железы (альдегиддегидраза обнаружена в печени млекопи­ тающих) .

К аэробным дегидрогеназам принадлежат ферменты, пере­ дающие водород, отнятый от окисляемого субстрата или от восстановленной формы анаэробной дегидрогеназы, промежуточ­ ному веществу или кислороду воздуха. Аэробные дегидрогена­ зы, Для которых акцептором водорода может служить исключи­ тельно лишь кислород воздуха, называются оксидазами. Актив­ ной группой аэробных дегидрогеназ является ФАД (флавина-: дениндинуклеотид):

n h 2

к N

7»