книги из ГПНТБ / Овчинников, А. И. Биохимия молока и молочных продуктов

видам брожения (правда, строгой границы между брожением лактозы и молочной кислоты провести нельзя, так как оба бро­ жения идут через стадию образования пировиноградной кисло­ ты). Бассе и Харпер [14] хроматографическим методом нашли в швейцарском сыре пировиноградную кислоту, а-кетоглютаро- вую, а-ацетомолочную кислоту, следы щавелевоуксусной, щаве­ левоянтарной кислот, ацетоина и диацетила. Причем пировиноградная кислота была ими обнаружена в неожиданно больших количествах — от 0,1 до 0,5 мг на 1 г сыра. Пировиноградная кислота была также найдена А. Чеботаревым в мягких сырах [277]. По его мнению, пировиноградная кислота образуется непосредственно из молочной при воздействии на нее лактатдегидрогеназы, которая в мягких сырах более активна, чем в твердых.

В-третьих, молочная кислота взаимодействует с составными частями сырной массы: вступает в ионообменные реакции с со­ лями, образует комплексные соединения с белками, нейтрали­ зует щелочные продукты распада белков н т. д. При ионообмен­ ных реакциях молочная ' кислота в первую очередь вытесняет свободную фосфорную и лимонную кислоты из их солей

1.Са (Н2Р 0 4)2 + 2СН3 СНОП СООН-----> 2Н3Р 0 4 +

+(СН3 СНОП СОО)2 Са,

2.C6H50 7Na3 + ЗСН3 СНОП СООН-----> С„Н80 7 +

+ЗСН3 СНОН COONa.

Эти реакции обычно протекают в самом начале образования молочной кислоты, т. е. в сырной ванне. При достижении сырным зерном pH 6,25 молочная кислота вступает в ионообменную реакцию с параказеин-кальций-фосфатным комплексом. Отщеп­ ление кальция молочной кислотой от белкового комплекса является сложным процессом, который нуждается в дальнейшем тщательном изучении. Кальций содержится в комплексе в двух формах: одна часть связана с белками, другая в виде коллоид­ ного фосфата кальция каким-то путем присоединена к внешней поверхности белковой мицеллы. Количество общего кальция, содержащегося в белковомкомплексе и связанного непосред­ ственно с белком, постоянно и составляет, по данным А. Бе­ лоусова [20], 149- 10-5—178- 10-5 г-экв на 1 г белка и 55* 10~5— 5810~5 г-экв, соответственно. При pH выше 5,3 происходит преимущественно переход в растворимое состояние фосфата кальция, отщепление же кальция, связанного с белком происхо­ дит при pH ниже 5,3. Полное отщепление этой формы кальция происходит в зоне pH 4,3 и 4,0 (рис. 5).

Накопление молочной кислоты и ее ионнообменное взаимо­ действие с белковым комплексом в сильной степени влияет на

200

качество сыра [15—20, 213]. А. Овчинников и П. Ведяшкин (1950) установили, что консистенция сыра■находится в тесной зависимости от содержания кальция в параказеине: чем больше кальция в белке, тем консистенция сыра ближе к резинистой, в сырах с низким содержанием кальция наблюдается крошлицая консистенция. Позднее А. Белоусов в своих исследованиях [20] пришел к таким же выводам (рис. 6).

К альц и и /б е л о к , Ю ' - г - э к б / е

с ы р с к р о ш л и в о й к о н с и с т е н ц и е й ( С а м е ­ н е е 6 0 -1 0 —5 г - э к в /г ) .

Таким образом, образующаяся при созревании сыра молоч­ ная кислота не накапливается в нем в свободном виде, а всту­ пает во взаимодействие с составными частями сырной массы, оказывая тем самым влияние как на сам процесс созревания, так и на качество сыра. Для получения сыра хорошего качества нежелателен как излишек, так и недостаток молочной кислоты. При высоком содержании молочной кислоты подавляется дея­ тельность молочнокислых бактерий, выделяющих нужные для дальнейшего созревания сыра экзо- и эндоферменты. Кроме того, большое количество молочной кислоты вызывает нежелательные изменения в белково-кальций-фосфатном комплексе, что в свою

201

очередь отразится, на консистенции и рисунке сыра. Наоборот, при более низком содержании молочной кислоты (pH выше 6) создаются благоприятные условия для развития гнилостных бак­ терий, которые могут образовать ряд веществ, снижающих каче­ ство сыра.

Изменение белковых веществ

В основе созревания сыра лежит биохимическое разложение белковых веществ. Под влиянием сычужного фермента и фер­ ментов молочнокислых бактерий белки сырной массы распада­ ются с образованием многочисленных азотистых соединений. Степень участия сычужного фермента в созревании сыра вызывает много споров. Кристаллический сычужный фермент имеет низкую протеолитическую активность и продукты его ферментативной реакции относятся к полипептидам с относи­ тельно высоким молекулярным весом. Технические препараты сычужного фермента содержат примеси других протеаз, попа­ дающих из сычугов жвачных животных и обладают более высо­ кой протеолитической активностью.

Петерсон, Джонсон и другие исследователи считают, что роль сычужного фермента в созревании сыров незначительна, основное участие в этом процессе принимают бактериальные ферменты. Такое мнение подкрепляется исследованиями Н. Куз­ нецовой и других, которые наблюдали уменьшение количества сычужного фермента по мере обработки зерна до 3—12% от введенйого в молоко и полное его исчезновение в сырах с высо­

По мнению этих авторов, 90% растворимого азота сыров образуется в результате совместного действия сычужного фер­ мента и, протеолитических ферментов молочнокислых бактерий. Сычужный фермент вызывает первичный распад казеина, даль­ нейшее изменение продуктов распада осуществляют ферменты молочнокислых бактерий. Подтверждением участия сычужного фермента в распаде белков служат работы Линдквиста и Сторгардса [177, 178]. На основании электрофоретических исследо­ ваний они установили три стадии распада белков шведского сыра (близкого к нашему российскому сыру) под действием сычужного фермента. На первой стадии распадается и-казеин («неспецифическое созревание»), на второй — р-казеин, исчезаю­ щий через 3 месяца (p-созревание), и в конце созревания, т. е. через 75 дней, начинается распад а-казеина (а-созревание). По мнению авторов, данный распад казеина вызывает сычужный

202

фермент, бактериальные же ферменты действуют в основном на продукты распада казеина, полученные под действием сычуж­ ного фермента. В некоторой степени они расщепляют и сами белки, что подтверждается расщеплением пика а-казеина на более ранней стадии созревания. По данным [8], Lbm, casei и Lbm. plantarum гидролизуют а- и р-казеины одновременно, отдавая лишь незначительное предпочтение a-фракции. Эффек­ тивность совместного действия сычужного фермента и молочно­ кислых культур хорошо демонстрируют опыты сотрудников ВНИИМСа (1963) по приготовлению закваски с внесением фермента [146]. В закваске без сычужного фермента через 24 ч содержание азота свободных аминокислот достигало 3,05 мг%, в той же закваске с ферментом — 9,95 мг%. В молоке с фермен­ том (контрольная проба) его концентрация составляла всего

0,05 мг%.

Таким образом, сычужный фермент выполняет две функции: быстро свертывает молоко при слабокислой реакции (pH 6,6) и осуществляет неглубокий протеолиз белков с образованием продуктов, которые способствуютразвитию молочнокислых бактерий, осуществляющих дальнейший их распад. Главным источником протеаз и других ферментов, а следовательно, и ос­ новным .фактором созревания сыра, являются молочнокислые бактерии. Расщепление белков под действием бактериальных протепназ и пептидаз идет главным образом за счет разрыва пептидных, дисульфидных и других связей. Происходит посте­ пенный распад, белков на протеозы и высокомолекулярные полипептиды, затем на более мелкие пептиды и, наконец, на аминокислоты. Одновременно идет последовательное отщепле­ ние аминокислот и их пептидных цепей от параказеина и поли­ пептидов.

Степень распада белков характеризуют продукты их распада. Сравнительно недавно все исследования сводились к определе­ нию азота в продуктах распада, которые делили на три фрак­ ции: нерастворимый в воде белковый остаток, растворимые белковые соединения и небелковая фракция, содержащая низко­ молекулярные пептиды, свободные аминокислоты, амиды и ам­ миак. Учет вышеприведенных фракций азотистых веществ в сырах давал только общее представление о процессе созрева­ ния сыра. На этой основе' возникло понятие «обширность» и «глубина» распада белков. Считалось, что мягкие сыры созре­ вают в «обширность», а твердые — в «глубину». По данным Г. Иннхова, в мягких сырах параказеин подвергается гидроли­ тическому распаду на 70—80%, в твердых сырах белок распа­ дается примерно на 30%. Такая характеристика созревания сыров в настоящее время не может считаться правильной, тем более, что содержание аминного азота в мягких сырах немного меньше, чем в твердых, а в некоторых даже и выше (табл. 35) [152, 153, 277].

203

Таблица 35

Содержание отдельных фракций азотных соединений в различных сырах (по И. Климовскому и А. Чеботареву)

Полную картину изменения азотистых веществ сыра при созревании дает схема исследования белков, предложенная Всесоюзным научно-исследовательским институтом маслоделия и сыроделия [146]. По этой схеме в сыре на различных стадиях созревания определяют:

204

И. Климовским проведено исследование белков голландского сыра на всех стадиях созревания на основе разработанной схемы [146, 150, 151]. Выяснено, что во время созревания коли­ чество нерастворимых белков уменьшается, но на любой стадии созревания сычужных сыров их содержание остается высоким. Нерастворимая фракция голландского сыра состоит в основном из параказеина, не затронутого ферментативным процессом (82,8—88,2% всех азотистых веществ фракции) и белковоподоб­ ных веществ, не содержащих фосфора. Последние при­ надлежат к продуктам распада параказеина н представляют собой, по-видимому, крупные концевые полипептидные цепи, в составе которых отсутствуют группировки серинфосфорной

кислоты.

Ферментативный распад параказенна сопровождается обра­ зованием растворимых в воде азотистых соединений, количество которых непрерывно увеличивается. К ним относятся раствори­ мые в воде белковые соединения, состоящие из двух фракций (белки, осаждающиеся уксусной кислотой и белки, осаждаю­ щиеся трихлоруксусной кислотой), пептиды и аминокислоты. Растворимые в воде белковые фракции содержат больше фос­ фора, чем параказеин, что свидетельствует не о простом дроб­ лении параказеина, а о протеолизе, при котором не происходит разрыва эфирных связей фосфорных остатков с аминокислотами белка (или же он происходит очень медленно). Разрыв эфирных связей сопровождался бы нарастанием в сыре количества неор­ ганического фосфора, по наблюдению же И. Климовского, его содержание в голландском сыре в течение четырех месяцев, остается постоянным. Таким образом, растворимые белки пред­ ставляют собой остатки молекул параказеина, от которых отще­ пились отдельные аминокислоты и их пептидные цепи. Сотруд­ ники Литовского филиала ВНИИМСа [42] с помощью колоноч­ ной хроматографии выделили из сыров 5 фракций растворимых белков. В процессе созревания сыра ими наблюдалось уменьше­ ние или полное исчезновение четырех низкомолекулярных фрак­ ций и интенсивное увеличение высокомолекулярной фракциирастворимых белков. По их мнению, при созревании сыра про­ исходит не только протеолиз белков с получением низкомолеку­ лярных продуктов, но и образование высокомолекулярных белковых продуктов из низкомолекулярных компонентов .с ак­ тивными радикалами на концах молекул.

Пептидные фракции представляют собой смесь пептидов с различным молекулярным весом. Содержание фосфора в пеп­ тидах больше, чем в растворимых белковых веществах, следо­ вательно, количество фосфора в промежуточных продуктах распада параказеина увеличивается со степенью их дроб­ ления. Ниже приведены данные К. Климовского по со­ держанию фосфора в азотистых веществах голландского сыра [151]:

205

Отношение азота к

г-атом фосфору,—

П араказем н ....................43—46

Растворимый белок (1-я

ф р а к ц и я ) ................... 35—37

В первой пептидной фракции обнаружены также пептиды, не содержащие фосфора, происхождение их следует объяснить отщеплением от параказеина концевых пептидных цепей, кото­ рые не имеют в своем составе фосфорнокислых групп.

В водорастворимой части азотистых соединений сыра содер­ жатся свободные аминокислоты, изучение-которых представляет большой интерес в связи сд х участием в создании вкуса сыра. Особенно, детально эта фракция стала исследоваться в' послед­ ние годы после_ развития хроматографических методов анализа. В результате хроматографического 'разделения в сырах обнару­ жено 13—19 свободных аминокислот. В табл. 36 представлен состав аминокислот отдельных видов сыров, вырабатываемых в Швеции [255], в табл. 37 — состав аминокислот 10 видов сыров, вырабатываемых в Советском Союзе [277, 276]. В табл. 37 пред­ ставлен для сравнения состав аминокислот гидролизатов казеина, альбумина, а также гидролизатов растворимых и не­ растворимых белков зрелых сыров.

По данным [278] в гидролизатах насчитывается семнадцать аминокислот: аргинин, гистидин, лизин, цистин,' аспарагиновая и глютаминовая кислоты, глицин, серин, треонин, аланин, метио­ нин, пролин, тирозин, триптофан, лейцин, фенилаланин, валин. При сравнении состава свободных аминокислот, выделенных из зрелых сыров, выяснено, что в нем отсутствуют аргинин, серин и мдтионин, не во всех сырах обнаружен гистидин. В то же время в исследованных сырах были обнаружены орнитин, а-ами- номасляная и у-аминомасляная кислоты, которые отсутствуют

вгидролизатах белков.

Впроцессе созревания сыров некоторые аминокислоты под­ вергаются разложению, некоторые превращаются в новые ами­ нокислоты. Отсутствующие в зрелых сырах серин и метионин могут служить материалом для синтеза цистеина

206

Таблица 36

Содержание свободных аминокислот в сырах*

(по Сторгардсу и Линдквисту)

* Знак «+ » — низкое содержание; « + + » — среднее, « + + 4 -» — высокое, «—» — аминокислота отсутствует.

207

Таблица 37

Содержание свободных аминокислот в зрелых сырах (по А. Чеботареву)

Образовавшийся при этом гомосерин может превращаться

ву-аминомасляную кислоту, которая была обнаружена в зрелых сырах. Исчезновение аргинина в зрелых сырах объясняется пере­ ходом его в орнитин, который обнаружен во многих исследуе­ мых сырах. Превращение аргинина в орнитин происходит путем отделения амидиновой группы ферментом аргиназой, .выраба­ тываемой некоторыми видами микроорганизмов, обнаруженных

всырах:

208

соон

Аргинин

Обнаруженная среди свободных аминокислот у-аминомасляная кислота может образоваться из глютаминовой кислоты при ее декарбоксилировании

соон

Качественный и количественный состав свободных амино­ кислот зависит от вида сыра, влажности, температуры второго нагревания, состава бактериальных заквасок, возраста сыра и других факторов. Поэтому в одном и том же виде сыра раз­ ные исследователи находят различное количество свободных аминокислот. Изменение содержания свободных аминокислот на разных стадиях созревания в дорогобужском и швейцарском сырах по данным [102, 278] представлено в табл. 38, а в гол­ ландском по данйым [102] — в табл. 39.

Из таблиц 38 и 39 видно, что в процессе созревания сыров суммарное количество аминокислот непрерывно увеличивается, причем концентрация одних кислот возрастает по мере созре­ вания, а концентрация других — достигает максимума и затем снижается.

Факт снижения количества некоторых аминокислот свиде­ тельствует о дальнейшем их распаде. Свободные аминокислоты Нод действием окислительно-восстановительных ферментов мик­ роорганизмов дезаминируются, вступают в реакции

209