книги из ГПНТБ / Овчинников, А. И. Биохимия молока и молочных продуктов

Они содержатся в больших количествах в различных белках молока (глютаминовой кислоты до 23,0%) и играют важную* роль в обмене вещества. Глютаминовая кислота обладает вкусом и запахом куриного бульона (соли глютаминовой кис­ лоты применяют в качестве вкусовой приправы).

Аминокислоты белка лизин и аргинин относятся к диаминомонокарбоновым аминокислотам и имеют следующее строение:

Лизин и аргинин вследствие наличия двух аминных групп, относятся к основным аминокислотам. Аргинин имеет вторую

в молекуле казеина взаимодействует с фосфорной кислотой, образуя аргининфосфорную кислоту [105, 106].

Циклические аминокислоты. В состав белков молока входят следующие циклические аминокислоты: фенилаланин, тирозин, триптофан, гистидин, пролин. Из них наиболее важными являются:

( СН2 - СН — СООН

n h 2

Фенилаланин (а-амино-р-фенилпропионовая кислота)

СН2- С Н - С О О Н

n h 2

Тирозин (а-амино-р-оксифенилпропионовая кислота)

и / \ . СН2 - СН - СООН

Триптофан (а-амино-р-индолилпропионовая кислота)

30

Триптофан и фенилаланин не синтезируются в организме чело­ века « должны поступать с пищей. Они так же, как и метио­ нин, треонин, валин, лейцин, изолейцин, лизин, принадлежат к числу так называемых «обязательных» или «незаменимых» аминокислот. При развитии гнилостной микрофлоры в кишеч­ нике человека и молочных продуктах (сыр и другие) триптофан

итирозин образуют ядовитые продукты: фенол, скатол, индол

ит. п.

Аминокислотный состав белков молока, по данным ряда

•исследователей, представлен в табл. 9.

Таблица 9

Аминокислотный состав белков молока (по Гордону, Смиту и другим авторам)

С о д е р ж а н и е , % , в

* Дан состав ранее известного псёвдоглобулина, который .аналогичен иммунному глобулину • G1, являющемуся основным глобулином этой группы по новой номенклатуре.

31

К а з е и н

Общая характеристика и фракционный состав. Содержание казеина в коровьем молоке колеблется от 2,3 до 2,9%. Среднее содержание казеина в женском молоке 0,9%, в молоке кобы­ лицы— 1,2%, в молоке овцы — 4,5%. Впервые казеин был вы­ делен из молока при подкислении в 1838 г. Мульдером (Нидер­ ланды). Впоследствии для выделения казеина и получения его в чистом виде широко использовался метод Хаммарстена, сущ­ ность .которого заключалась в осаждении казеина уксусной кислотой из обезжиренного молока, тщательном промывании осадка водой, а затем обработке спиртом и эфиром [131, 345]. В настоящ'ее -время для получения фракций казеина имеется значительное количество модификаций этого метода (спиртовой

и вкуса с удельным весом 1,259. Порошкообразный казеин практически нерастворим в воде и жирорастворителях — эфире, спирте, ацетоне и др. Он растворяется только в слабых раство­ рах щелочей, солей щелочных и щелочноземельных металлов, уксусной, лимонной, фосфорной и салициловой кислот.

Порошкообразный чистый казеин гигроскопичен; при сравни­ тельно непродолжительном хранении на воздухе он поглощает значительное количество влаги. Так, по подсчетам И. Путило­ вой 100 г казеина может присоединить 26,56 г воды. Адсорбция воды казеином зависит от относительной влажности воздуха. П. Дьяченко определил экспериментально, что при 100% отно­ сительной влажности воздуха к 100 г казеина присоединяется

углерод 53,0; водород 7,0; азот 15,7; кислород 22,6; сера 0,8; фосфор 0,8. Молекулярный вес казеина точно не определен. Многие исследователи, применяя разнообразные методы определения (химический, ультрацентрифугирование, метод светорассеяния и др.), приводят самые различные вели­ чины молекулярного веса казеина. Так, Сведберг и Карпентер нашли молекулярный вес казеина равным 375 000; В.; Виленский и Т. Касторская— 24 500; П. Дьяченко и И. Влодавец — 32 000; Берк и Гринберг— 33 600; Хиппель и Вог— 15 000' [105, 112, 131,’345]. Так как казеин является гетерогенным белком и пред­ ставляет собой комплекс различных фракций, количественные соотношения которых не постоянны, то более правильным явля­ ется определение молекулярных весов отдельных его фракций.

32

По новейшим данным, молекулярные веса фракций казеина колеблются в пределах от 19 000 до 30 650 (табл. 8).

Длительное время казеин считали ' однородным веществом и только в 1939 .г. Мелландер, применяя электрофорез в фос­

ний техники фракционирования и очистки Уорнер (1944 г.) выделил в чистом виде а- и p-фракции казеина. Позднее Лембке и Кауфманн (1.953), а затем Сведберг, Л. Карпентер и Д. Карпентер, подвергая казеин электрофорезу, также раз­ делили его на три фракции а, р, у. Такие же результаты полу­ чили и другие исследователи. Таким оДразом, считалось уста­ новленным, что казеин молока есть комплекс по крайней мере трех фракций, состоящий из а-казеина, р-казеина и у-казеина

[344].

Вопрос количественного содержания фракций казеина, судя по литературным данным, оставался й остается в настоящее время спорным. Большинство исследователей приводит такие данные: а-казеина содержится 45—63%; р — 19—28%; у —• 3—7%- Е. Жданова и И. Влодавец (1959), применив при элек­ трофорезе буферные растворы, содержащие 40% мочевины, получили другие данные по содержанию фракций казеина: 36,6% а-казеина; 56,9% р-казеина и 6,5% у-казеина [120]. Разница в количественном содержании отдельных фракций ка­ зеина в молоке объясняется не только особенностями -пород коров, периодом лактации, но и методами фракционирования. Кроме того, электрофоретический анализ может давать не точ­ ные результаты в силу комплексообразования между отдель­ ными компонентами казеина (например, в методе Ждановой

иВлодавца р-казеин комплексуется с х-казеином) [368].

В1956 г. Вог и Хиппель [447] впервые определили, что а-казеин является гетерогенной фракцией, состоящей из двух частей; чувствительной к ионам кальция (а8-казеин) и нечув­

ствительной к ионам кальция (к-казеин). Таким образом, в настоящее время казеин рассматривается как комплекс че­ тырех фракций [411]: as-, х-, р-, у-казеина. Выделенные фракции ‘отличаются друг от друга в основном поаминокислотному составу (табл. 10), содержанию фосфора, серы, менее — азота! Элементарный состав фракций казеина по данным [308, 411’, 457] следующий:

По новой номенклатурной схеме принята следующая термино­

мая из раствора нефракционированного а-казеина хлористым кальцием низкой концентрации. Количественно составляет боль­ шую часть а-казеинового комплекса. Очень чувствительна к ионам кальция. , Содержит генетически изменчивые формы компонента asl - (варианты' А, В, С, D) и as-подобные компонен­ ты as2,3,4 - [296, 436—438, 448, 457]. Компоненты as-казеина еще недостаточно изучены.

х-Казеин — фракция a-казеинового комплекса, растворимая в растворе хлористого кальция, стабилизирующая as-казеин по отношению к ионам, кальция. х;Казеин, в отличие от других фракций, содержит мало фосфора, «о содержит углеводы и еиаловую кислоту. По данным зарубежных исследователей, сычужный фермент в первой фазе сычужного свертывания

34

молока действует на х-фракцию. При этом образуется нераство­ римый пара-х-казеин и растворимый глико,макропептид [301, 313, 353]. Гликомакропептид, по данным Браннера и Томпсона, содержит 11,7% азота, 0,63 фосфора, 5,1 гексозы, 2,3 глкжозамина и 11,3% сиаловой кислоты [310]. В коровьем молоке содержится два генетически изменчивых варианта х-казеина, отличающихся содержанием ала'нйна, треонина, изолейцина и аспарагиновой кислоты [387, 389, 415, 454]. Каждый вариант имеет несколько компонентов, отличающихся содержанием угле­ водных цепей (от 0 до 5). Основной компонент не содержит углеводы, поэтому растворимую часть х-казеина, отщепляемую сычужным ферментом, предлагается называть не гликопепти­

дом, а пептидом [411].

р-Казеин — фракция нефракционированного казеина, раство­ римая в 3,3 М растворе мочевины и .нерастворимая в 1,7 М растворе мочевины при pH 4,6. р-Казеин не. чувствителен к ионам кальция при низких температурах, но агрегируется ими при температуре 35° С. В молоке отдельных коров наблю­ дается несколько генетически обусловленных вариантов [435,

436, 438, 439].

у-Казеин — фракция исходного казеина, растворимая в 3,3 М растворе мочевины, но нерастворимая в 1,7 М растворе моче­ вины при pH 4,7, после добавлениясернокислого аммония. у-Казеин, по сравнению с а- и Р-казеином содержит мало фос­ фора. (0,11%) и много серы (1,03%) [308, 344, 411, 441]. Фрак­ ция у-казеина содержит также генетически обусловленные варианты (табл. 8)-. Генетический полиморфизм у-казеина свя­ зан каким-то образом с генетическим полиморфизмом р-казеи- на. у-Казеин еще мало изучен. Содержание отдельных фракций в молоке и их молекулярные веса представлены в табл. 8.

Химические свойства. Казеин является фрсфопротеином, т. е. содержит в своем составе остаток фюсфорной кислоты, каким образом он связывается с молекулой казеина, в настоя­ щее время точного ответа еще дать нельзя, .так как имеющиеся литературные данные слишком противоречивы. Не вызывает сомнения только то, что фосфор в казеине связывается через гидроксильные группы аминокислотных остатков серина и трео­ нина.

По данным исследования Перельман, фосфор в казеине образует три типа связей — моноэфирная, диэфирная и пиро­

35

он

Диэфирная

ОН'

Пирофосфатная

Перельман считает, что в а-казеине 40% фосфора связано, моноэфирной связью, 40 — диэфирной и лишь 20% фосфора находится в виде пирофосфата; в р-казеине 72% фосфора свя­ зано диэфирной связью. Наличие диэфирной и пирофосфатной связей дает основание Перельман* сделать выводы, что в моле­ куле казеина фосфорная кислота выполняет роль связующих «мостиков» между отдельными полипептидными цепями ана­ логично серным. ” .

Однако многие исследователи с выводами Перельман не согласны и считают, что в казеине может иметь место только одна моноэфирная связь фосфорной кислоты (Гофман, Петер­ сон, Линдквист). Другие допускают наличие фосфоамидной связи фосфора с гуанидиновой группой аргинина по типу:

и фосфоамидная связи фосфора, с серином и гуанидиновой группой аргинина:

36

Казеин имеет ряд свободных функциональных групп, кото­ рые обусловливают его способность вступать в химические взаимодействия. Такими реактивноспособными группами могут являться: —СООН, —NH2, —NH, —ОН, NH СО , HS , —NH—С—NH2 и другие. Из них наибольшее значение имеют

NH

карбоксильные и аминные группы, так как часть этих групп находится в свободном состоянии и определяет химические «свойства казеина. Вследствие наличия данных свободных групп казеин в растворах образует амфионы, т. е. может легко всту­ пать в реакцию как с кислотами, так и с основаниями:

Если бы казеин в растворах имел одинаковое количество сво­ бодных карбоксильных групп (СООН) и аминогрупп (NH2), то раствор имел бы нейтральную реакцию и одинаковое количе­ ство отрицательных и положительных зарядов. Однако казеин

•обладает ярко выраженными кислотными свойствами, а равен­ ство положительных и отрицательных зарядов (изоэлектрическая точка) наступает .при pH, равном 4,6. Следовательно, коли­ чество свободных кислотных групп СООН в казеине больше, чем основных — NH2. В настоящее время еще нельзя точно сказать, сколько имеется в казеине свободных СООН и НгН-групп, да и вообще едва ли можно утверждать, что кислотные и основные свойства казеина обусловлены только этими двумя полярными группами. Вероятнее всего, что кислотные и основные свойства зависят и от других диссоциированных групп, что подтвержда­ ется. опытами П. Дьяченко [105].

Электрометрическое титрование казеина кислотой, проведен­ ное П. Дьяченко^-показывает, что общее количество водородных ионов, присоединенное к 1 г казеина при pH 2,4, составляет около 6-10~4 г-экв, которые связываются как с концевыми диссоциированными карбоксильными группами моноаминокис­ лот и частично дикарбоновых, так и С .амидными группами (—СО—NH2). При титровании щелочью при pH 12,1 общее количество ОН-ионов, соединившееся с ионами водорода, со­ ставляет 2,1-10—3 г-экв. Ионы водорода при этом ©тдают как

37

аминные группы, так и амидозольные группы гистидина, фе­ нольные— тирозина и гуанидиновые — аргинина.

Таким образом, казеин следует рассматривать как поли­ валентный амфолит, содержащий катионные и анионные груп­ пы,'вследствие чего он может образовывать целый ряд соеди­ нений со многими химическими веществами: кислотами, осно­ ваниями, металлами, альдегидами и другими.

Особый интерес представляют соединения казенна с форм­ альдегидом н альдозами, так как они имеют не только теоре­ тическое, но и практическое значение (получение искусствен­ ного волокна из казеина, побурение молока при нагревании и т. д.). Химизм реакции между казеином и формальдегидом хорошо изучен П. Дьяченко и К. Шеллаковой [105]. Как уста­ новлено, формальдегид может реагировать с различными функциональными группами казеина, образуя ряд так называе­ мых метиленпроизводных.

Аминные группы, в зависимости от pH среды, дают разные типы метиленпроизводных. Так, в щелочных растворах (при pH 9,2—12) одна молекула формальдегида связывается с одной аминогруппой, образуя два типа соединений:

В шейтральной или слабокислой среде (при pH 4,6—6,25) одна молёкула формальдегида взаимодействует с двумя аминогруп­ пами казеина, образуя соединение типа:

2R - NHo + СН20 ----> R — NH — СН, - HN — R + Н20 .

Аналогичные соединения казеин дает с ацетальдегидом и акро­ леином.

С амидными и иминными группами казеина формальдегид дает оксиметпленпроизводные и метнленпронзводные:

~Имин

3.2 R - C H = NH + C H ,0 ---- >

----> R - СН = N - СН2 - N = СН — R + Н20 .

Метиленпроизводное

Гидроксильные и сульфгидрильные группы казеина обра­ зуют с формальдегидом соединения двух типов:

38 .

Карбоксильные и гуанидиновые группы аминокислот казеи­ на в реакцию с формальдегидом не вступают. Аргинин, имею­ щий гуанидиновую группу, реагирует с формальдегидом через «-аминогруппу.

Казеин, вступивший в реакцию с формальдегидом, резко изменяет свои физико-химические свойства: не растворяется в воде, слабо набухает в концентрированных растворах щело­ чей и кислот. Кроме того, казеин, обработанный альдегидами, не расщепляется ферментами, а, следовательно, не подверга­ ется гниению. В этом случае казеин становится подобным кератину шерсти, что и послужило причиной его использования для изготовления пластических масс. При реакции казеина с формальдегидом, вследствие образования метилированного казеина, происходит блокирование свободных аминогрупп с по­ терей их основных свойств, что приводит к увеличению кислот­ ности казеина. Это свойство казеина используется при опреде­ лении содержания белков в молоке методом формольного титрования [113, 133].

Казеин может также реагировать и с другими химическими веществами, имеющими свободные альдегидные группы, в част­ ности с лактозой и глюкозой, образуя соединения типа меланоидинов. Эти реакции хорошо изучены П. Дьяченко и Ли, кото­ рые установили, что казеин взаимодействует с глюкозой и лак­ тозой путем реакции свободных а-аминогрупп казеина с альде­

Казеин-лактоза

39