Билогическая азотфиксация

Запасы молекулярного азота в воздухе практически ненеистощимы. Над 1 км² земнй noвepxности в атмосфере содержится около 8 млн. тонн азота. Но молекулярный азот не может быть усвоенным никаким организмом на Земле, кроме некоторых прокарют. Азот может усваиваться еукарютными организмами только в форме неорганических i opraHических соединений. Недостаток связанных форм азота в почве является одним из факторов которые лимитируют развитие растений

Связывание азота может происходить абиотическим путем - при електричних розрядах в атмосфере, извержениях вулканов, пожарах и др. Но количество азота, который связвается таким образом, невелико, и процесс этот неурегулирован.

Способность к биологической фиксации молекулярного азота имеют только некоторые прокариотические оргажзмы благодаря наличию у них специального фермента - нитрогеназы.

Азотфиксацией називается восстановление молекулярного азота до аммиака ферментом нитрогеназой в клетках азотфиксирующих бактерий. Биологическая азотфжсащия является главным источником усвоения азота в биосфере.

С.М. Виноградский в 1883 р. впервые выделил чистую культуру бактерий, и назвал ее Clostridium pasteurianum, и доказал способность фиксировать ими азот. М. Бейеринк в 1901 году выделил чистую культуру азотфиксирующей бактери - Azotobacter chroococcum.

Изучение биологической фжсации азота атмосферы до начала 50-х годов XX ст. проводилось путем активного поиска микроорганизмов-азотфиксаторов путем выявления на безазотистых средах. 3 середины XX ст. начали использовать изотопный метод и было установлено, чо фиксировать азот способны микроорганизмы таких poдов: свободноживущие Clostridium, Azotobacter и бактерии, которые способны фксировать азот в симбиозе с бобовыми растениями - это клубеньковые бактерии рода Rhizobium.

Благодаря использованию чувствительного ацетилен-этиленового метода определения активности нитрогеназы. Оказалось, что к азотфиксации способны широкий круг микроорганизмов, которые относятся к разным таксономическим группам. Было достоверно доказано, что фиксировать атмосферный азот не способны грибы, растения и животные. Асоциативные диазотрофы живут на корнях i стеблях ррастений, питаются фотосинтетическими продуктами, которые экскретуются наружу и фиксируют молекулярный азот. Эндотрофные диазотрофы в межклетниках тканей растений и используют продукты их фотосинтеза. Обнаружены такие виды, которые могут существовать как в ризосфере, так и в межклетниках.

В настоящее время азотфиксирующие микроорганизмы по способу жизнедеятельности делят на свободноживущие (Azotobacter, Clostridium, Klebsiella), асоциативные, которые живут на корнях растений (Azospirillum, Flavobacterium), ендофные(Acetobacter i Azoarcus, Anabaena, Nostoc), внутриклеточные симбионты (Rhizobiaceae с бобовыми растениями, Nostoc с Gunnera).

Биoxимия азотфиксации.

Вязывание азота у микроорганизиов происходит благодаря нитрогеназам по общей схеме:

Нитрогеназа

N₂ + 8Н* + 8 е +16 АTФ------------ 2 NH₃ + Н₂+ 16АДФ+16 Фн.

Как видно с уравнения, процесс фиксации азота является энергойомким. Подщитано, что на 1 г фиксированного азота расходуется 100-200 г глюкозы.

Нитрогеназный комплекс состоит из трех субъедениц - а, b и у, а также двух кофакторов: железо(Fe)-содержжащего и молибден-железо(МоFе)-содержащегого. Обнаружена также нитрогеназа, которая не содержит металлов. Нитрогеназа имеет две субъеденицы:

Динитрогеназа, передает електроны на N₂ и Н^{+ (}МоFе)-содержащий белок, в состав которого входит 2 атома Мо ипо 24-32 атома Fе и S. Вторая субъединица, редуктаза нитрогеназы, донор электронов для динитрогеназы, Fе-содержащий белок. Имеет один кластер 4Fе4S. Виявлеы также альтернативные нитрогеназы, у которых молибден замещен ванадием или вольфрамом. Альтернативные нитрогеназы, как и MoFe- нитрогеназа, состоят из двух компонентов и инактивируются при контакте с кислородом.

Ужкальною е здатнють альтернативних нпрогеназ вщновлювати ацетилен (С2Н2) до етану (С2Н6). Уникалиной является способность нитрогеназы восстанавливать ацетилен до этилена, на чем и основан ацетиленовый метод определения активности нитрогеназы.

Была открыта альтернативная супероксид-зависимая СО_З-нитрогеназа, которая стабильна при контакте с кислородом и даже нуждается в нем.

Будова н(трогеназ е уыверсальною для ecix азотфжсуючих бакте- рШ. Доказом ун1версальност1 е дан1 про те, що штучна ытрогеназа, яка складаеться з компоненте, взятих у р1зних бактер1й, вщновлюе свою активность.

Синтез нитрогеназ кодируется сложной системой генов. Так для хорошо изученного азотфиксатора Klebsiella pneumoniae система включает 25 генов, которые собраны в один кластер. В дальнейшем из аммиака синтезируются аминокислоты, благодаря ферментам глютамин- и глутаматсинтетаз.

Наиболее эффективными азитфиксаторы являются симбиотические микроорганизмы. Симбиоз, который образуется между бобовыми растениями и клубеньковыми бактериями (ризобиями), называется бобово — ризобиальным..

Формированиебобово-ризобиального симбиоза- многостадийный процесс, который складывается с прединфекционных взаимодействий (1), проникновения бактерий в ткани корня (2), формирования (морфогенеза) клубеньков (3), функционирования симбиотического аппарата, фиксации азота в клубеньках (4), отмирания и разрушения клубеньков (5).

1. Педиинфекционное взаимодействие состоит в обмене сигнальными молекулами, вследствии чего бактерии переходят из свободноживущего к симбиотическому состоянию. Процесс проникновения ризобиум в клетку называется нодулящей, а способность бактерии входить у в контакт с коренями растений, проникать в них и визывать образование клубеньков называется вирулентностью. Для того чтобы проникнуть в ткань корня, бактеря должна иметь преимущества перед другими клубеньковыми бактериями. Бактерии двигаются в сторону корневых волосков в ответ на выделение растением углеводов, аминокислот, органических кислот.

С другой стороны растение должно контролировать развитие бактерий и не допускать чрезмерного размножения ризобий и фитопатогенов. Поэтому эксудаты растений содержат вещества, которые угнетают развитие клубеньковых бактерий. По химическому составу это разнообразные соединения: антибиотики, гликозиды на основе танина, а також производные фенолов. Наличие этих веществ обуславливает видовую и сортовую чувствительность растений к бактериям. Збалансированность веществ положительного и негативного действия на ризобии способствует комплементарности микpo- и макросимбюнтов.

Прикрепление клеток ризобий к корневому волоску происходит в две фазы. Внешние слои оболочкиризобий, состоящие из экзоплисахаридов (ЭПС) контактируют с клетками корневых волосков. Первичное прикрепление бактерий происходит благодаря взаимодействию ЭПС с лектинами растений. Далее узнавание партнеров происходит благодаря взаимодействию детерминантных групп липополисахаридов (ЛПС) клеточной стенки ризобий с лектинами растений. Лектины стимулируют рост бактерий партнеров. Кроме того под влиянием ЛПС ризобий в корнях растений разрастаются ткани — образуются клубеньки.

После прикрепления у бактерй наблюдаетсяся реакция на растительные флавоноиды, которые взаимодействуют с бактериальным белком NodD, который связан с внутренней мембраной ризобиальной клетки. При взаемодействии с флавоноидами белок NodD изменяет свою конформащию, в результате чего он может активировать транскрипцию генов нодуляции - nod-генов, которые контролируют синтез Nod- факторов, яю за химической природой являются липо-хито-олигосахаридами, кторые состоят из остатков N-ацетилглюкозамну и радикала ненасыщенной жирной кислоти (С16-С20). Последние инициируют ранные стадии развития клубеньков. У ризобий установлено более 50 nod-генов.

2. Проникновение ризобий происходит через кореневые волоски. Nod- факторы у концентрациях 10^-8 -10^-12М вызывают деполяризацию клеточной мембраны кореневого волоска и модуляцию ионных потоков в клетках эпидермиса в следствие чего волосок скручивается.

В месте прикрепления бактерии наблюдается размягчение клеточной стенки. В этом процессе принимают участие пектинолитические ферменты - полигалактуроназы и протопектиназы. Эти ферменты могут синтезироваться как самими ростениями, так и ризобиями.

3. Формирование симбиотического аппарата - клубенька. В закрученном корневом волоске ризбиум образуют так называемую инфекционную нить - слизевой тяж, в котором находятся активно размножающиеся клетки клубеньковых бактерий. Nod-гены контролируют процесс скручивания волосков и формирование инфекционной нити.

В месте наибольшего изгиба волоска происходит гидролиз клеточной стенки и инвагинация плазмалемы вместе с мембранными структурами растительной клетки - апаратом Гольджи, ендоплазматическим ретикулумом. Как результат происходит "захват" ризобиум, и вокруг клетки образуется своеобразный тунель- инфекционная нить, которая заполнена полисахаридным матриксом, в котором находятся бактериальные клетки. Инфекционная нить находится в межклеточном пространстве и за 2-3 суток достигает основания кореневого волоска.

Одновременно с этим происходит заложение клубеньковой меристемы. Эта стадия називается Ced от англ. Cortical cell division). Далее начинаются дифференциация клеток клубенька, стад1я Ntd от англ. Nodule tissue differentiation). В конце этой стадии сформирована, покровная, проводящая й азотфиксирующая части клубенька. В это же время инфекционная нить достигает клубенька. В заключительной стадии Ваг (от англ. Bacterial release) происходит переход ризобий из инфекционной нити в растительную клетку. В месте входа нити в растительную клетку образуются мембранные пузырьки которые содержат бактерии. Таким образом, ризобии в растительной клетке окружены перибактериальной мембраной с участием аппарата Гольджи и эндоплазматического ретикулума. Этот комплекс называется симбиосома и является основной единицей симбиоза.

После образования симбиосом бактерии переходят с формы бацил в бактероиды которые в 3-5 раз больше палочек и имеют разную форму. Эта стадия називаеться Bad (от англ. Bacteroid differentiation). В этот период синтезируется нитрогеназа, которая катализирует восстановление N₂ до NH₃ а также ферментов, которые обслуживают нитрогеназную реакцию. Одновременно с синтезом нитрогеназы происходит синтез легоглобина.

В этот период ткани корня в месте инфецирования разрастаются и образуется клубенек. Основними компонентами клубенька являются инфецированные клетки, элементы сосудистопроводящего пучка и меристема, обеспечивающая рост клубенька. Есть клубеньки с меристемой, они цилиндрической формы и клубеньки шаровидной форы, которые не содержат меристемы. Клубенек образуется за 3-4 недели.

Среди генов. Контролирующих симбиоз выделяют две группы:

а) Nst-гены ответственные за синтез тех белков, которые присутствуют в растительных клетках, но их синтез усиливается в клубеньках.

б) нодулины - гены которые появляются de novo в клубеньвах с развитием симбюза.

Развитие ризобий в растении контролируется растением. При образовании симбиоза бобовых установлены процессы, сходные с защитными реакциями растений при их повреждении фитопатогенными бактериями: синтез этилена, фенолов, хитиназ, пероксидаз. В отличие от патогенеза, результатом которого является инактивация бактерий, при симбиозе происходит регуляция размножения ризобий.

4. Фиксация азота - это основная функция симбиотической системы. Азотфиксация начинаетс тогда, когба образуется бактероид, в котором происходит интенсивный синтез нитрогеназы. Ее содержание достигает 30% от общего содержания белков в бактероидах.

Функционирование нитрогеназного комплекса у бобовых кодуется nif- генами, которые контролируют структуру белков, образование кофакторов, регуляцию процессов синтеза. В отличие от свободноживущих азотфиксаторов симбиотические не имеют блокировки нитрогеназного комплекса связанными формами азота. Это объясняется тем, что в условиях избытка связанного азота функцию регуляции берет на себя растение.

Растение-хозяин исполняет также функщию защиты нитрогеназного комплекса от кислорода. Это происходит двумя путями:

1) образование диффузионного барьера клетками коры клубенька;

2) синтезом белка легоглобина с высоким сродством к кислороду. С помощью этого белка кислород транспортируется в симбиосому. Кодируется легоглобин Lb-генами.

В бактероидах синтезируется также гем, связанный с биогенезом цитохромов, которые обеспечивают транспорт электорнов к нитрогеназе. Присутствие гемовых соединений обуславливает розовую окраску клубеньков.

Со своей стороны, бактероиды имеют свою «кислородную защиту» которая осуществляется разветвленной системой электронтранспортных цепей (ЭТЦ). Одни ЭТЦ работают в аэробных, а другие в анаэробных условиях.

Енергетическое обеспечение азотфиксации осуществляется за счет продуктов фотосинтеза растений в форме сахарозы; для азотфжеации растение осуществляет гликолиз, а образующийся малат поступает в бактероид. В микросимбионте происходит эергетически наиболее выгодная часть катаболизма - цикл тркарбоновых кислот. Фиксированный азот ассимилируется в форме аммония, который включается в метаболизм растительной клетки (перпичная ассимиляция), потом образуются транспортные формы фиксированного азота например, аспарагин, глутамин), которые поступают из клубеньков в проводящую систему.

5.Отмирание и разрушение клубеньков. В фазе бутонизации растений активность азотфиксации стремительно возрастает и достигает максимума в фазе цветения. В фазе образования бобов интенсивность азотфиксации снижается и при созревании плодов клубеньки уже почти не функционируют. В составе корневых остатков они разрушаются в почве. В почве присутствуют и не эффективные клубеньковые бактерии. Для обеспечения эффективного симбиоза целесообразно семена обрабатывать препаратами высокоэффективных азотфиксаторов.

рослин заражати' високоактив- ними специф1чними культурами ризобм, яю е основою бактер1альних добрив (див. роздт 10.1).

Симбиоз с цианобактериями

Азотфиксирующие цианобактерии могут образовывать симбиоз с широким кругом растений--покрытосеменных, голосеменных, папоротникообразных, мхами. Значительное влияние на азотфиксацию имеет содержание минерального азота в почве. Минеральный азот угнетает азотфиксирующую деятельность микроорганизмов. Объясняется это тем, что в клетках NH₃ выполняет роль репрессора нитрогеназы и обслуживающих ферментов. При таких условиях микроорганизмы переключаются на использование аммиака. А те, которые имеют нитратредуктазный комплекс и на использование N0₃^-, поскольку этот процесс энергетически более выгодный, чем усвоение N₂. Небольшие стартовые дозы фиксированного азота не угнетают симбиотической азотфиксации. Стартовые дозы необходимы для стимуляции развития растения на начальных этапах, для формирования фотосинтетического аппарата, который необходим для обеспечения азотфиксации энергетическим материалом. В зависимости от типа почвы, стартовые дозы колеблются от 20 до 40 кг/га действующего начала. Дальнейшее увеличение доз азотных удобрений угнетает азотфиксацию. Экологическое значение биологической фиксации прежде всего в реализации энергетически выгодной по сравнению с химической фиксацией азота. Микроорганизмы единственные на земле могут выполнять этот процесс и вовлекать атмосферный азот в биологический круговорот.